DB37T 3802-2019 花生品种鉴定技术规程 SSR标记法

ICS65.020B 04DB37山东省地方标准DB 37/T 38022019花生品种鉴定技术规程SSR标记法Protocol for identifying peanut varietySSR marker method2019 - 12 - 24发布2020 - 01 - 24实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 38022019前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省花生研究所。本标准主要起草人：闫彩霞、单世华、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。15花生品种鉴定技术规程SSR标记法1 范围本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）标记法进行花生（Arachis hypogaea L.）品种鉴定的术语与定义、仪器设备、试剂与溶液配制、引物信息、鉴定方法、数据读取与判定方法。本标准适用于花生品种的鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则NY/T 2237植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南花生3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列simple sequence repeat，SSR由几个核苷酸（16个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。3.2推荐引物recommended primer根据最少引物区分最多品种的原则筛选出的一套SSR引物，具有条带清晰、多态性高、重复性好、均匀分布的特点，用于DNA分子数据的采集和品种鉴定。3.3参照品种reference variety具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异扩增片段的大小，校正仪器设备的系统误差。4 仪器设备所用仪器设备见附录A。5 试剂、溶液配制及引物信息5.1 试剂及溶液配制试剂及溶液配制见附录B（除特殊说明外，所用试剂均为分析纯）。5.2 引物信息推荐引物的相关信息见附录C。6 鉴定方法6.1 样品准备6.1.1 样品为花生种子及其他植物组织。种子样品的分样和保存，按照GB/T 3543.2的规定执行。6.1.2 每份样品中至少随机抽取10个个体，每个个体单独分析。如样品为种子，水培法种植，至第三片真叶长出后备用。参照品种（见附录D）各种植2粒，混合分析。6.2 样品的DNA提取6.2.1 DNA提取取花生幼嫩组织50 mg，放入组织破碎仪中，液氮研磨。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，室温风干，加入100 L 1TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5 L RNAase，37 温育1 h，20 下保存留用。6.2.2 DNA浓度和质量检测利用0.8 %琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Gold View染料进行染色。测定DNA溶液的OD260/OD280值，在1.82.0范围内最佳。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算DNA的浓度。稀释至工作浓度为30 ng/L，置于4 下备用。6.3 PCR扩增6.3.1 参照品种的使用在进行PCR扩增和等位基因检测时，不同SSR引物的参照品种参见附录C。6.3.2 反应体系总体系为10 L，包括4.5 ng/L DNA，0.8 mol/L F/R引物，1Dream Taq Green PCR Master Mix，1.9 L蒸馏水，混匀。6.3.3 反应程序95 预变性3 min；95 变性45 s，55 退火45 s，72 延伸45 s，进行35个循环；72 延伸5 min；4 下保存备用。6.4 PCR产物检测6.4.1 玻璃板组装清洗玻璃板和样品梳，晾干。用无水乙醇擦拭凹板和平板各2遍，待玻璃板彻底干燥后，将1.0 mm厚的塑料边条整齐摆放在平板两侧，盖上凹板，对齐，夹紧，用水平仪调平。6.4.2 制胶根据凝胶的面积和数量，调整6%聚丙烯酰胺凝胶溶液的用量，分别加入1 的APS和1 的TEMED，轻轻摇匀，防止产生气泡，迅速灌胶。待胶液充满玻璃板夹层，在上部凹面处轻轻插入样品梳平端，深度约0.8 cm。室温下静置1 h，使胶液聚合，如室温较低可适当延长聚合时间。6.4.3 电泳准备将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1TBE缓冲液，至下槽液面约为槽高的1/3，上槽液面高于玻璃板凹面约1 cm。拔去梳子，冲洗胶孔，清除底层气泡和杂质。将样品梳齿端插入凝胶1 mm2 mm处。6.4.4 上样PCR产物中加入1/6体积的6loading buffer，微量移液器上样，每孔加入2 L PCR扩增产物（上样量可根据加样孔的大小适当调整）。20 bp DNA Ladder分子量标记加入两侧加样孔中，对应参照品种的PCR产物加入中间加样孔中，检测样品PCR产物加入其余加样孔中。6.4.5 电泳电压为200 V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示带到达胶板底部，停止电泳，电泳时间一般为2 h。6.5 银染显色6.5.1 水洗电泳结束后，分开两块玻璃板，取出凝胶，用蒸馏水快速漂洗2次，不超过10 s。6.5.2 银染将凝胶转移至适量染色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇10 min。6.5.3 水洗将凝胶从染色液中取出，在蒸馏水中快速漂洗2次，时长8 s10 s。6.5.4 显影将凝胶转移至适量显色液中，使其完全浸没，在摇床上轻摇至带纹清晰。6.5.5 漂洗将凝胶转移到蒸馏水中清洗，直至蒸馏水澄清。6.6 成像将凝胶置于凝胶成像系统的工作台上，选用透射紫外光观察，调节至图像最清晰，保存。7 数据读取与判定方法7.1 数据读取利用凝胶分析软件Quantity one读取条带，每个SSR位点的等位变异大小用扩增片段长度表示，单位为bp。与对应的参照品种进行比较，校正系统误差，确定送检样品在每个位点的等位变异大小，获得送检样品27个SSR位点的指纹图谱。7.2 判定方法根据送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数，对送检样品进行鉴定。 当送检样品与相应品种指纹图谱的差异位点数2，则判定为“不同品种”； 当差异位点数=1，判定为“近似品种”； 当差异位点数=0，判定为“疑同品种”。对于差异位点数1个的送检样品，应按GB/T 19557.1给出的原则和NY/T 2237给出的方法进行田间测试，确定送检样品在表型性状上是否与对应品种一致。AA附录A （规范性附录）仪器设备A.1 组织破碎仪温控范围为40 室温。A.2 高压灭菌锅灭菌温度为105 136 ，最大工作压力为0.22 MPa。A.3 凝胶成像系统分辨率不低于400百万像素。A.4 高速冷冻离心机最大离心力不小于15 000 g。A.5 PCR扩增仪控温范围为0 100 。A.6 紫外可见分光光度计波长范围为190 nm1 100 nm。A.7 恒温水浴锅温度范围为室温99 。A.8 水平摇床转速为0 rpm230 rpm。A.9 微波炉最高耐温120 。A.10 电子天平精确到0.01 g。A.11 电泳槽样品通量为1.0 mm厚。A.12 磁力搅拌器转速为0 r/min2 500 r/min，控温范围为室温100 。A.13 酸度计测量范围为0.00 pH14.00 pH。A.14 微量移液器量程分别为2 L、10 L、100 L、200 L、500 L和1 000 L。BB附录B （规范性附录）试剂及溶液配制B.1 试剂B.1.1 乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）。B.1.2 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）。B.1.3 盐酸（HCl，36 %）。B.1.4 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。B.1.5 氯化钠（NaCl）。B.1.6 硼酸（Borate）。B.1.7 丙烯酰胺。B.1.8 甲叉双丙烯酰胺。B.1.9 四甲基乙二胺（TEMED）。B.1.10 无水乙醇。B.1.11 过硫酸铵（APS）。B.1.12 硝酸银（AgNO3）。B.1.13 琼脂糖。B.1.14 6loading buffer。B.1.15 Gold View染料。B.1.16 RNAase（10 mg/mL）。B.1.17 酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）。B.1.18 异丙醇。B.1.19 四硼酸钠。B.1.20 甲醛。B.1.21 2Dream Taq Green PCR Master Mix。B.1.22 SSR引物（10 mol/L）。B.1.23 20 bp DNA Ladder。B.1.24 重蒸水或符合GB/T 6682规定的一级水.B.2 溶液配制B.2.1 1mol/L NaOH4 g NaOH，加蒸馏水定容至100 mL。B.2.2 1mol/L Tris-Cl（pH8.0）溶液称取121.1 g Tris，加蒸馏水定容至1 L，浓盐酸调至pH8.0，高压灭菌备用。B.2.3 0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶液称取186.1 g EDTA-Na2，800 mL蒸馏水，加热定容至1 L，1 mol/L NaOH调至pH8.0，高压灭菌备用。B.2.4 1TE1 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），加蒸馏水定容至100 mL。B.2.5 DNA提取液4 g CTAB，16.364 g NaCl，20 mL 1 mol/L Tris-Cl（pH8.0），8 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），加蒸馏水定容至200 mL，4 条件下保存。使用前加入2 %的巯基乙醇，实验前预热至65 。B.2.6 70 %乙醇700 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1 L。B.2.7 10TBE缓冲液分别称取108 g三羟基氨基甲烷，55 g硼酸，加入800 mL蒸馏水加热溶解，再加入0.5 mol/L EDTA（pH8.0）溶液37 mL，加蒸馏水定容至1 L。B.2.8 1TBE缓冲液100 mL 10TBE，加蒸馏水定容至1 L。B.2.9 10 %APS0.5 g APS溶于5 mL蒸馏水中。B.2.10 6 %聚丙烯酰胺凝胶溶液（29:1）分别称取58 g丙烯酰胺，2 g甲叉双丙烯酰胺，100 mL 10TBE，加蒸馏水定容至1 L，4 条件下保存。B.2.11 染色液称取1 g硝酸银，加蒸馏水定容至1 L。B.2.12 显色液6 g NaOH，0.2 g四硼酸钠，1.6 mL甲醛，加蒸馏水定容至400 mL。CC附录C （资料性附录）推荐引物推荐引物见表C.1。表C.1 推荐引物引物连锁群引物序列（53）常见等位变异（bp）参照品种Ah1TC5A06A07F-tcggtttgggagacactcttR-ttgtaagcagacgccacatc160zh.h2461162zh.h5075164166zh.h2406zh.h1961168zh.h0949172zh.h2250176zh.h2405180zh.h2764188zh.h0537Ah2TC11H06B04F-ccatgtgaggtatcagtaaagaaaggR-ccaccaacaacattggatgaat168zh.h2413174zh.h2499182zh.h5399198zh.h0930202zh.h2405206zh.h2764210zh.h4749Ah3TC23C08B06F-agcagagtggaaaacgaagaagR-gtcagtttgtgaatcgggtttt89zh.h474991zh.h503493zh.h240699zh.h0861101zh.h1797103zh.h1585AHGS0138B10F-catattgacggtgatggcagR-ccgaccctaatcctaatacaaca150zh.h5060154zh.h2462162zh.h2405164zh.h2682168zh.h5034174zh.h2069表C.1推荐引物（续）引物连锁群引物序列（53）常见等位变异（bp）参照品种AHGS0151A05F-agcaaatgaaggtgagggtgR-gcccaaaaatgctaacgaag65zh.h233068zh.h241390zh.h2250108zh.h2405112zh.h2591115zh.h5075118zh.h5034AHGS0599未定位F-agattggtggtgacagaggcR-gccatcgatgtaaccctcac233zh.h0949236zh.h5399253zh.h2250260zh.h0525263zh.h2405266zh.h2466GM1843未定位F-cccacacacacacacacactaR-aggtgatgctgcgtttcttt66zh.h223174zh.h158582zh.h053186zh.h225090zh.h260894zh.h2462GM1996B03F-catcccatcattttccctcttR-tacagtgaaggtgggatcctg77zh.h503485zh.h532787zh.h139589zh.h276492zh.h2405GM2638A04F-atgctctcagttcttgcctgaR-cagacataacagtcagtttcacc45zh.h168955zh.h270257zh.h238463zh.h474965zh.h532769zh.h225073zh.h0949GNB357未定位F-aggtttgctttgggatgatgR-ccgataaaaccaggcaagaa191zh.h5034194zh.h1602197zh.h2406203zh.h0537215zh.h0861218zh.h1331表C.1推荐引物（续）引物连锁群引物序列（53）常见等位变异（bp）参照品种GNB317未定位F-gaaaagcttgcaaaatcgagaR-tccttccatgttggtgaatg188zh.h2550194zh.h0540197zh.h2561200zh.h2405203zh.h2764212zh.h5034224zh.h2462227zh.h0537230zh.h4749GNB556A01F-tcagggtgggttaccaacatR-taatccacattgaaccgacg56zh.h052562zh.h093468zh.h241371zh.h241077zh.h086880zh.h223186zh.h1331PM308未定位F-ccttcttctttctcctcctcaR-caattcgtgatagtattttattggaca64zh.h503474zh.h474978zh.h097780zh.h276482zh.h246486zh.h240592zh.h0680pPGSseq19D6B05F-tttgttatgctcacaccccaR-aaaaatgaagcaatattttgttgttag180zh.h4779192zh.h2406200zh.h2508204zh.h0537210zh.h5034pPGPseq2C11A03F-tgacctcaattttggggaagR-gccactattcatcgcggta385zh.h2456403zh.h2764418zh.h4749439zh.h2405450zh.h2406461zh.h0436Ah2TC7C06A06F-ggcaggggaataaaactactaactR-ttttccttccttctcctttgtc130zh.h2405134zh.h2764142zh.h2413144zh.h5098146zh.h2250表C.1推荐引物（续）引物连锁群引物序列（53）常见等位变异（bp）参照品种Ah3TC20B05A08F-gcatgtaaactatgcaatcgctR-caacaacttattccaccaaatatca64zh.h503472zh.h240676zh.h246284zh.h532786zh.h0861Ah590B03F-caaaacgcaatgcaaggtacgR-acgaacgtgcagcaagaagaag144zh.h5060162zh.h0949180zh.h2405190zh.h0764194zh.h2250200zh.h0977AHS2037A10F-tggccttgattactctcgctR-acaggggtctggaggaagtt312zh.h2405318zh.h1315321zh.h4749327zh.h5034342zh.h5075Ai119F10B05F-tggcaattgattagagattagaR-cagaagaggtgggagaga222zh.h2405226234238254zh.h1602zh.h4749zh.h0537zh.h0099GNB320未定位F-gaattcctggctcgaacttgR-acccctccatttcgtcttct332zh.h2462334zh.h2177336zh.h4749342zh.h0977GNB329未定位F-ccctttttcgctttcttcctR-gttctcgtttgtgccctctc208zh.h2764211zh.h0977217zh.h2405223zh.h5060238zh.h1315PM210B06F-ccgcagatcttctcctgtgtR-cctcctcatcctctaaactctgc179zh.h2208183zh.h2562187zh.h2425193zh.h5030196zh.h5365201zh.h2426表C.1推荐引物（续）引物连锁群引物序列（53）常见等位变异（bp）参照品种IPAHM23B08F-gtgtcttttcgttcgcgattR-cgactcttagggtggattatagtaaga59zh.h240574zh.h246277zh.h2069PM358A07F-ccacaaacagtgcagcaatcR-tcaaaggccatttcatcaca138zh.h1816141zh.h2561143zh.h2413149zh.h4673PM375未定位F-cggcaacagttttgatggttR-gaaaaatatgccgccgttg100zh.h4749110zh.h0861150zh.h2406152zh.h2076pPGPseq2D12BB02F-aagctgaacgaactcaaggcR-tgcaatgggtacaatgctaga288zh.h2764294zh.h0102300zh.h2405318zh.h0537330zh.h0678DD附录D （资料性附录）参照品种名单参照品种名单见表D.1表D.1 参照品种名单序号种质库统一编号品种名称序号种质库统一编号品种名称1zh.h0099赣榆小站秧34zh.h2384英德白沙鸡豆仔2zh.h0102启东赤豆花生35zh.h2405试花1号3zh.h0436蒲庙花生36zh.h2406试花3号4zh.h0525锦交1号