凝集反应

临床免疫学实验指导海南医学院,实 验 要 求 与 实 验 室 规 则,实验课要求： 1. 课前预习，明确目的，了解实验内容与方法。阅读实验指导 2. 实验过程严肃认真，按实验规程操作，要有严格的科学态度 3. 仔细观察如实记录实验现象与结果，按时独立完成实验报告 实验室规则： 1. 进入实验室必须穿整洁的隔离衣，严禁在实验室内高声喧哗 2. 禁止在实验室内饮食，吸烟和做与实验无关的其他事情 3. 节约实验用品，爱护仪器设备，如有损坏及时报告老师 4. 强化安全意识，注意水电安全。值日小组认真整理卫生， 保持实验台面清洁整齐，实验废物放入指定的垃圾桶内。,临床免疫学实验指导,第一部分 抗原抗体反应（Antigen-Antibody Reaction） 抗原抗体反应概念： 是指相应的抗原-抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。 主要应用： 1.用已知抗原检测未知抗体，抗体效价 2.用已知抗体检测未知抗原，明确病原生物 抗原-抗体结合反应常用实验方法： 凝集反应 沉淀反应 补体结合实验 免疫标记实验技术实验目的：掌握抗原抗体结合反应的原理，方法及其应用,第一节 凝集反应（Agglutination）,反应原理： 颗粒型抗原与相应抗体在电解质溶液中出现凝集的想象 凝集反应方法： 直接凝集：颗粒性抗原和相应抗体直接出现凝集反应 间接凝集：先将可溶性抗原吸附于大分子颗粒载体 表面,再与相应抗体结合发生凝集反应。 具体实验内容与方法： 玻片凝集试验：伤寒沙门氏菌与痢疾志贺式菌的检测，用已知抗血清 检测患者体内未知抗原。 操作见实验指导 试管凝集试验（微量反应板法）：用已知颗粒性抗原与被检血清混合， 然后观察试管内有无凝集，并观察血清凝集效价，判断抗体浓度。 间接凝集试验（类风湿因子检测 RF）：属自身免疫性疾病 受外界刺激，机体IgG变性，产生抗原性（RF），刺激自身产生抗变性 IgG抗体，此抗体与RF因子结合形成免疫复合物沉积于病变部位。,抗原抗体反应示意图,NaCl,可见反应,直接凝集反应,定义： 凝集反应指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原的颗粒状物质(如红细胞、聚苯乙烯胶乳等)，与相应抗体结合，在一定条件下，形成肉眼可见的凝集团块现象。 实验目的： 掌握抗原抗体结合反应的原理，方法及其应用 属免疫学最简单最直接最常用的基础实验,实验一 凝集反应,用已知的抗血清检测被检样品中有无相对应的抗原,【实验内容】 玻片凝集： 常用已知抗血清检测未知抗原，定性 试管凝集：可检测未知的抗原或抗体并能报告凝集效价 一、玻片凝集反应（定义） 当颗粒性抗原与相应的抗体发生特异性结合时，两者 比例适宜，在电解质溶液中呈现肉眼可见的颗粒状 凝集，此现象称凝集反应。,【实验材料】1. 1:20痢疾免疫血清，1:20伤寒免疫血清。2. 伤寒沙门菌菌液，痢疾志贺菌菌液。3. 生理盐水，玻片，微量移液器，消毒缸等。,一、玻片凝集反应,取清洁玻片两张，用记号笔，玻璃蜡笔作出标记和画好分区，按实验指导要求加样操作。,【方法】 1. 取洁净玻片2张，各用记号笔划分三等份。 2. 在玻片的左上角分别标记1和2。 3. 按下列要求依次加入反应物。各种加量均为20微升 4. 转动玻片，充分混匀1-2min后观察反应结果并作出解释。 解释说明出现凝集和不出现凝集的依据。 ,生理 1：20伤 1：20痢盐水 血清 血清 + + + 伤寒沙 伤寒沙 伤寒沙 门菌 门菌 门 菌,生理 1：20伤 1：20痢 盐水 血清 血清 + + + 痢疾志 痢疾志 痢疾志 贺菌 贺菌 贺 菌,二、试管凝集反应【实验原理】,将待检血清作对倍稀释后，加入等量的已知颗粒性抗原与待检血清混合，抗原与不同稀释度的抗体在试管内直接结合而出现的凝集现象称为试管凝集反应。此法是一种半定量法。 常用已知抗原(如细菌悬液，RBC悬液)来测定被检血清中 相应抗体的水平(效价或滴度)。 用于检测被检血清中是否存在和已知抗原相应的抗体 及抗体的效价：如；患者血清中免疫性抗体检测。 例如 孕妇血清中免疫性IgG检测，用于新生儿溶血病的诊断、 病毒感染后，患者抗病毒抗体产生情况的观察,【材料】 11:20伤寒免疫血清。 2伤寒沙门菌菌液，甲型副伤寒沙门菌菌液。 3生理盐水，TIP头，微量移液器， 4. U型微量反应板。见下图 5恒温培养箱等。,方法: 取U型微量反应板，做好标记，加样,小心加样！ 取U型微量反应板（做好个人或小组标记）于两横排110孔中各加入生理盐水 每孔50l。 分别在两横排的第1孔内加入1:20伤寒免疫血清 50l， 每排各从第1孔开始作对倍稀释至第9孔， 从第9孔混匀后弃去50l。第一横排从第10孔至第1孔各加入伤寒沙门菌菌液50l/孔 第二横排同法各加入甲型副伤寒沙门菌菌液50l/孔。充分混匀后，置45恒温箱孵育1h后取出。 室温静置15min，最好在黑色背景下，观察并报告结果。,血清对倍稀释方法： 用微量移液器将第1孔的溶液连续吸吹三次，使其充分混匀。吸出50l移入第2孔 。同法吸吹三次使充分混匀后再吸出50l移入第3孔，如此作对倍稀释至第9孔，吸吹混匀后吸出50l弃去。此时第19孔的血清稀释度依次增加一倍，即血清对倍稀释法或倍比稀释法。注意：做倍比稀释吸取时插到管底，吹出时离开 液 面，沿孔壁吹出。动作要连续轻巧，切勿出错,孔 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理盐水（l） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 1:20伤寒 50 50 50 50 50 50 50 50 50 免疫血清（l） （弃去50 ） 血清稀释度 1:40 1:80 1:160 - - - - -1:10240 菌液（l） 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50血清最终稀释度 1:80 1:160 1:320 -1:20480 充分混匀后，置45孵育1h，取出室温静置15min 观察结果,试管凝集试验操作与稀释图示,第一排：每孔加入伤寒沙门菌 菌液 50l。 菌液要充分混匀！ 第二排：每孔加入甲型副伤寒沙门菌 菌液 50l 。,【结果观察与判定】,观察结果：先观察生理盐水阴性对照孔（10空） 此孔不发生凝集，呈混悬菌液。液体混浊，管底 沉淀物呈圆形，边缘整齐。此沉淀物是在静置 过程中细菌因重力作用自然下沉形成。轻轻摇动 呈混悬液。 然后自第1孔开始依次观察孔内液体的混浊程度及孔底凝集块的大小。 以出现明显凝集（）管号的血清滴度报告结果 如：4孔+，5孔+，6孔+。则报告为：1：640,凝集物 上清液 凝集程度 全部凝集 澄清透明 +（凝集块大，为最强凝集） 大部份凝集 基本透明 + （凝集块较大，为强凝集） 有明显凝集 半透明 +（凝集块明显，为中度凝集） 很少凝集 基本混浊 +（凝集块不明显，为弱凝集） 不凝集 混 浊 - （未见凝集块，为不凝集）,+ + + + - 强凝集 明显凝集 弱凝集,凝集效价判定,1.观察第一排1-9管的凝集情况，作出判定： 凝集效价（血清凝集滴度）的判定： 以能与一定量的抗原发生肉眼可见的 明显凝集（+）的血清最高