PCR检验技术

PCR (Polymerase Chain Reaction)检验技术,黑龙江中医药大学临床医学院 诊断教研室黄 萍,第一节 概述,一. 何为PCR？ PCR聚合酶链反应 英文全称 polymerase chain reaction 简称为PCR,第一节 概述,二 PCR的基本原理 PCR聚合酶链反应实际上是一种快速的特定DNA 片断在体外扩增技术。 简单的说： DNA的特性三步曲: 高温变性 低温退火 中温延伸 通过一个热循环仪（DNA扩增仪）将特异片断的基因(DNA.又叫模板DNA）在短时间内，经过引物Taq酶和三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）等作用后，放大到几百万倍。最后得到能肉眼看到的DNA区带或可定量分析的DNA量。,第一节 概述,三 简单复习一下DNA的结构与复制 生命是由蛋白质合成的 蛋白质是由无数氨基酸连接成肽链而合成的 氨基酸则是由无数个基因即DNA组成的 这就是说DNA是蛋白质的生命,第一节 概述,DNA的基本构成单位： 脱氧核糖 核苷酸 磷酸 核苷酸有4种碱基： A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 G鸟嘌呤 C胞嘧啶,第一节 概述,DNA的基本构成单位：C-胞嘧啶 ( G)A-腺嘌呤 (T)T-胸腺嘧啶 ( A)G-鸟嘌呤 (C)脱氧核糖磷酸氢键,第一节 概述,DNA的基本构成单位： 在DNA结构中，4种碱基，以AT、GC 进行严格配对的。 AT、GC排列顺序的变化是 无穷无尽的。 人体中大约有30亿（3X109）DNA的基因组。 碱基的顺序是DNA的生命。,第一节 概述,RNA与DNA的区别： RNA的核糖是不脱氧的五碳糖 RNA的4种碱基是 A.U.G.C A腺嘌呤 U尿嘧啶 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U在DNA中对应的碱基是T（胸腺嘧啶）,第一节 概述,RNA与DNA的区别： 核糖 脱氧核糖,第一节 概述,碱基以3个为1组（三联密码）DNA ATG AAG AGT GTC CAT CAC TAAmRNA AUG AAG AGU GUC CAU CAC UAA蛋白质 甲硫氨酸 赖氨酸 丝氨酸 缬氨酸 组氨酸 组氨酸 无意义ATG（AUG）：起始密码，是转译的开始TAA（UAA）：终止密码，是使1条肽链的合成到此中止。CAT（CAC） 简并密码，是一种氨基酸，可以有多于CAU（CAC） 1个的三联密码，但也是特定的。,第一节 概述,DNA与蛋白质合成的关系 用Watson和Crick的中心法则说明则是： 转录 翻译 DNA mRNA 蛋白质 逆转录,第一节 概述,DNA与蛋白质合成的关系 先由在细胞核中的DNA（基因）的碱基以3个为一组（三联密码）转录成mRNA的三联密码 mRNA来到细胞核外的核糖体（蛋白质合成的场所）上，且每一种三联密码指使一种特定的氨基酸同毗邻的氨基酸连接起来，变成了一种肽链（蛋白质）。这个过程称为转译。 如果合成的肽链很长的话，也可以形成立体结构的蛋白质。,第一节 概述,DNA的结构： DNA大分子以反向互补的两条单链形成双螺旋的立体结构。其形状多少有点象人们常见的小食品“麻花”。,第一节 概述, DNA的复制 半保留复制 DNA的复制过程先是两个链分开，然后两条亲代链均以各自为模板，复制另一条互补链，之后再形成子1代的双螺旋结构，继之再以同样的方式复制成子2代、子3代、子4代。 此时把这种复制方式称为半保留复制。,第一节 概述,基因突变： 基因突变，也就是碱基的突变。 例如。ATG编码是甲硫氨酸，但如果发生了基因突变，是ATG中的T变成了A，则三联密码变成了AAG，在新合成的蛋白质长链上与甲硫氨酸对应的位置上就只能是赖氨酸，而不再是甲硫氨酸了。这就是突变的本质。有时人体就因此发生病变。这也就是“突变”的主要实质。,第一节 概述,四 扩增HBVC基因片断为例 简述PCR原理 HBV病毒 是带有3182个碱基的双螺旋的双链DNA 步骤 1 前处理 2 基因扩增 3 电泳 4 检测报告,第一节 概述,基因扩增 模板DNAHBV病毒 950C 变性：使双链打开，变成两个单链，二个单链 是实验成败的关键 550C 退火：在合成原料d NTPs.Mg2+的作用下，模板DNA与引物 C 构成 二条杂交链,二条杂交链决定其实验的特异性 720C延伸：在Taq酶的作用下，以引物为起点，开始DNA链延伸反应，使链延长。形成一条新的链 对实验的特异性和产量有关！ 生成二个特异性的DNA片断，完成了第一次循环 生成的二个特异性的DNA片断，继续进行下一次循环，经过25-30次循环，模板DNA得到了大量的复制。HBV-C可扩增到几百万倍。,第一节 概述,理论上讲，DNA的产量是指数方式增加，即n次循环后，扩增产物拷贝数为r=2n 但是应该指出，扩增产物的指数式增加不是无限制进行的。在PCR反应后期，由于引物和底物的消耗，Taq酶活力下降等因素的影响，扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式。所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106-107。 如果想提高扩增产物的产量，可将产物DNA样品稀释1000-10000倍后，作为新的模板再进行第二轮PCR扩增。,第一节 概述, PCR 循环 - Step 1 - 热变性,第一节 概述, PCR 循环- Step 2 - 引物对 （Primer Pair）退火结合到靶序列,第一节 概述, PCR 循环- Step 3 - Taq DNA 聚合酶 催化引物延伸,第一节 概述, 第一个PCR 循环结束- 产生靶序列的两个拷贝 （Copies）,第一节 概述, 靶序列扩增,第一节 概述,上述的扩增是在PCR扩增仪上进行的。 然后将扩增产物经过EB电泳， 最后在紫外透射仪上进行鉴定、定量分析。,第一节 概述,第一节 概述,报告方式定性: PCR HBV-DNA + PCR HBV-DNA -定量: PCR HBV-DNA 1.00X103copies/ml PCR HBV-DNA 1.00X103copies/ml,第一节 概述,第一节 概述,第一节 概述,五 PCR技术的特点（一）特异性高 1. 以探测基因为目标。属于“病因诊断”，针对性强。对多种传染病，根据PCR检测结果可以确诊。 2. 在感染性疾病的基因诊断中，不仅可以检出正在生长的病原体，也可检出潜伏期的病原体。既可确定既往感染，也可确定现行感染。 尤其对那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体（梅毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等）采用PCR检查来确定感染就特别有效。 PCR检测的靶样品是病原体的核酸，与生物化学和免疫学检查相比，PCR结果与病原体分离培养结果更为一致，直接反应病原体的存在与否。,第一节 概述,（二）灵敏度高 在PCR扩增中，模板DNA以指数级迅速增加，样品中极其微量的靶序列在数小时内即可增加上百万倍，因此检测灵敏度高。 ELISA（酶联免疫吸附试验） 灵敏度高 ng RIA （放射免疫分析） 灵敏度高 pg PCR （聚合酶链反应） 灵敏度高 fg 理论上可检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在。可利用单一双倍体细胞。一根头发、甚至单一精子进行DNA定型。 从而提高临床诊断的阳性率和准确率。,第一节 概述,（三）简便快捷 有了扩增仪，有了商品化试剂盒，操作者不必自配各种试剂，只需将样品作简单处理和加样后，仪器即可自动循环进行扩增。许多PCR检查现在在数小时左右即可出报告。,第一节 概述,（四）对样品要求低 几乎所有的临床标本都可用于PCR扩增。 甚至低温保存多年的陈旧标本。 PCR检测病原微生物，并不要求标本中有存 活的病原体。病原体虽然失活，只需有完整 的靶序列核酸，PCR就可以检出来。 一些过去靠脑脊液，脊髓检查的项目PCR以 其高灵敏度和高特异性，从检查血、唾液或 尿标本同样可以得到一致的结果，为标本采 集带来方便，也使检测范围扩大和容易展开。,第一节 概述,(五) PCR的局限性 由于Tag酶缺乏3- 5端的外切酶活性，因而不能纠正 反应中发生的错误的核苷酸掺入，使PCR扩增产物有一 定程度的错误掺入。 但是错误掺入的碱基有终止链延伸作用的倾向，这 使得发生了的错误不会进一步扩大。 PCR由于高敏感性容易导致交叉扩增。在实验室污染的 情况下可能出现假阳性结果。,第一节 概述,(五) PCR的局限性 在引物针对范围过窄或存在抑制剂等影响下也可出现假 阴性结果。 PCR有优点也存在缺点。它是现有各种检验方法的一种 补充而不是替代。 尤其对一些生物化学、免疫学检验可以获得明确结果的情况下，就没有必要滥用PCR。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,（一）病毒的检测 1 PCR检测人类巨细胞病毒 （PCR HCMV DNA） 标本采集：尿液、血液、口咽部标本、 脑脊液、羊水、组织标本、 石蜡切片等。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1（PCR HCMV DNA）临床意义： HCMV属疱疹病毒科，是一种DNA病毒。本病的特征性病变是受感染细胞体积增大，胞核和胞浆内出现包涵体。此种病变细胞可见全身组织、器官，引起相应症状。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1（PCR HCMV DNA） 临床意义： HCMV感染后 轻者：呈亚临床不显性感染，即隐性感染 重者：在免疫功能低下者呈弥漫性病变，严重者甚至死 亡。多见于器官移植而接受免疫抑制剂治疗。 恶性肿瘤接受化疗后极易受HCMV的感染。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断, 孕期妇女由于内分泌及免疫状态的改变， 约有 7.7-10.2%的孕妇发生原发或继发感染 。病毒通过胎盘，引起胎儿的先天性感染。 可致流产、早产、死产。 一般急性感染指标阳性的孕妇，若胎儿情 况不佳，如胎心异常。胎儿腹水等，应立即 终止孕娠。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断, 受HCMV感染的早产儿可出现全身感染综合症， 即称为巨细胞包涵体病（CID），体征为全身 皮肤剥脱，点状出血，肝脾肿大，黄疸，血小 板减少，小头畸形，视力、听力障碍等。 因此HCMV是引起人类先天畸形的重要原因 之一，对社会的危害性很大。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,2 PCR检测风疹病毒 （PCR RV RNA） 标本采集： 血液、(血浆、血清) 羊水、,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,2 PCR检测风疹病毒 （PCR RV RNA）临床意义： 风疹病毒属于披膜病毒科，风疹病毒属，是RNA病毒。风疹又曾为德国麻疹，但较麻疹症状轻，合并症少。 受风疹病毒感染的成人，其症状类似一般感冒，其不同点是患者颜面、躯干、四肢发生类似麻疹样的红斑丘疹。多在1-3天消退，预后良好。 儿童少年期感染风疹症状比成人轻，甚至不显症状。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,2 PCR检测风疹病毒 （PCR RV RNA）临床意义： 孕妇受风疹病毒感染后，可经血液通过胎盘侵犯胎 儿，引起流产、死产。 一般孕妇在四个月以前处于风疹病毒急性感染 期，应立即终止妊娠。 受风疹病毒感染的活产者大约有20%胎儿表现先天 性风疹综合症。其表现： a.体重低于2500g且发育迟缓的低体重儿。 b.出生后全身器官受损，导致畸形，视力、听力障 碍，心血管系统异常等。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,3 PCR检测单纯疱疹病毒 （PCR HSV DNA） 标本采集：疱疹液、溃疡底部的刮取物、 唾液、结膜液、角膜刮取物、 阴道棉拭子（宫颈分泌物）、 脑脊液、脑活检标本等。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,3 PCR检测单纯疱疹病 （PCR HSV DNA） 临床意义： 单纯疱疹病毒（HSV）为一种双链DNA病毒，有两个血清型 HSV-I 主要侵犯腰部以上的部位，主要侵犯口、唇的皮肤 黏膜，引起眼、面部的感染 HSV-II 主要侵犯腰部以下的部位 一般与外生殖系统感染和新生儿感染有关。 如：引起生殖器疱疹 男性：阴茎、包头、龟头的损害 女性：子宫颈的病变 近年来I、II型合并感染为多见,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,3 PCR检测单纯疱疹病 （PCR HSV DNA） 临床意义： 孕妇感染HSV-II后可经胎盘或生殖道上行感染 引起胎儿宫内感染。 其后果与HCMV、RV、TOX的先天感染相似。 （自然流产、早产、死产） 一般孕妇若HSV-II急性感染指标阳性者应 终止妊娠。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,3 PCR检测单纯疱疹病 （PCR HSV DNA） 临床意义： 受HSV感染的婴儿，可为小头、脑钙化、 小眼球患儿。 或出生后4-5天发生发热、痉挛、 呼吸困难、出血倾向，以致死亡。病 死率高达90%。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,4 PCR检测人乳头瘤病毒 （PCR HPV DNA） 标本采集： 宫颈分泌物 （患者发病处的活组织及分泌物）,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,4 PCR检测人乳头瘤病毒 （PCR HPV DNA）临床意义： 是一种小的双链DNA病毒，可感染人的皮肤和粘膜 上皮细胞，诱发细胞增生，产生乳头瘤样病变。能引起传染性很强的生殖器湿疣。该病是性传播疾病。 女性患该病，病情严重时，可全身发臭，孕妇胎死腹中，引产困难。 HPV与宫颈癌、喉癌、口腔癌等恶性肿瘤密切相关。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,5 PCR检测EB病毒（PCR EB DNA） 标本采集： 咽拭子、尿液、 肺移植病人的肺组织等。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,5 PCR检测EB病毒（PCR EB DNA） 临床意义： EB病毒属于疱疹病毒科，是双链DNA病毒。 唾液传播是主要方式，偶尔可通过输血感 染。 引起淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增 多症。 与何杰金氏病、慢性疲劳综合症（CFS）、 器官移植后淋巴细胞增生症等有关。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,6 PCR检测柯萨奇病毒 （PCR CVB RNA） 标本采集： 血液,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,6 PCR检测柯萨奇病毒 （PCR CVB RNA）临床意义： 柯萨奇病毒是属于小核糖核酸的肠道病毒。 可引起广泛的骨骼肌肌炎和坏死。CVB主要引起心肌炎等疾病，并具有较高的发病率。 尤其是婴幼儿感染后死亡率较高。所以早期诊断是有重要的临床意义。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,（二）细菌的检测 1 PCR检测结核杆菌 （PCR TB DNA） 标本采集：痰、胸水、腹水、 脑脊液、尿、淋巴结、 胸膜活检组织、血液,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1 PCR检测结核杆菌 （PCR TB DNA） 临床意义： 结核病的发病率在世界范围内都有回升，我国在中青年及老年两个年龄组出现发病高峰。用PCR检测结核杆菌可提高其阳性率和准确性。 与直接涂片染色法相比：阳性率为40-50% 若1000条，阳性率仅4%PCR检测理论上可查出一个结核杆菌，达fg级量。且不受非致病菌性抗酸杆菌导致假阳性结果的干扰。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1 PCR检测结核杆菌 （PCR TB DNA） 临床意义： 结核的早期诊断 与结核杆菌的分纯培养相比 结核杆菌为专性需氧菌，培养条件要求高，要在含有鸡 蛋、甘油和土豆等丰富营养的培养基上生长。该菌生长缓慢， 18小时才繁殖一代，故接种4-6周才会出现肉眼可见的菌落。 因此靠培养结果达不到早期快速诊断的目的。 在结核杆菌感染的早期，特别是结核病灶通过血源性传 播时，在外周血中存在极少量的结核杆菌，PCR扩增就能给 予确诊。因为早期菌血症是较易得到控制的，以防继发性结 核病灶的形成。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1 PCR检测结核杆菌 （PCR TB DNA）临床意义： 鉴别诊断a.肺结核与肺癌的鉴别 对于肺结核，特别是结核球和成人原发性肺结核等，经常易与肺癌诊断混淆。 结核的中心部分经常出现坏死区，但既无结核杆菌，又未检到癌细胞，涂片染色也无抗酸菌，此时采用PCR检测就特别有效。因为PCR即可查能着色的活菌，也可查出不着色的死菌，只要该菌的DNA未破坏，就能检出。从而确诊病灶是良性还是恶性的。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1 PCR检测结核杆菌 （PCR TB DNA）临床意义： b 对于脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等形成的渗出 液标本，用PCR检测有无结核杆菌的存在， 可帮助寻找和确证病因。 C 用PCR检测尿液、精液标本中的结核杆菌DNA， 可为肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断提供 检验依据。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,2 PCR检测淋球菌 （PCR NG DNA） 标本采集： 生殖泌尿道分泌物 尿液及眼分泌物,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,2 PCR检测淋球菌 （PCR NG DNA） 临床意义： 人类是淋球菌唯一的自然宿主，为革兰氏阴性双球菌。是淋病的致病原。而淋病主要是由性接触而传染，淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖。 男性发生尿道炎 女性引起尿道炎和子宫颈炎 未经治疗或治疗不彻底，可扩散至生殖系统，形成慢性感染。 胎儿经产道时，在分娩过程中可被感染而患淋病性急性结膜炎。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,3 PCR检测沙眼衣原体 （PCR CT DNA） 标本采集： 生殖泌尿道分泌物 尿液、眼部分泌物,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,2 PCR检测沙眼衣原体 （PCR CT DNA） 临床意义： 沙眼衣原体的感染率和危害性在性传播疾病中超过了淋球菌，它可引起非淋球菌性尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、急性输卵管及盆腔炎。 沙眼衣原体，引起性病淋巴肉芽肿变种。 男性：侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。 女性：可侵犯会阴、肛门、直肠，引起会阴-肛门-直肠组织狭窄。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,3 PCR检测沙眼衣原体 （PCR CT DNA） 临床意义： 可导致沙眼，成人和新生儿包涵体结膜炎，婴儿沙眼衣原体肺炎等。 引起不育症，由子宫颈或子宫内膜反复地衣原体感染或因衣原体引起的精子免疫反应所致。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,4 PCR检测解脲支原体 （又称解脲脲原体） （PCR UU DNA） 标本采集： 生殖泌尿道分泌物 尿液,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,4PCR检测解脲支原体（PCR UU DNA) 临床意义： 导致非淋球菌性尿道炎 孕妇感染后，可发生如下并发症： 妊娠早期：引起受精卵脱落和妊娠终止 妊娠晚期：引起妊娠中毒症、羊水过多、早产、胎膜早破、 死胎等 分娩时：引起新生儿呼吸道感染 引起不育症，这可能是由于解脲支原体吸附于精子， 阻碍其运动，或其所产生神经氨酸酶样物质，干扰 精子与卵子的结合。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,5PCR检测肺炎支原体 （PCR MP DNA） 标本采集： 咽拭子 咽部分泌物 鼻咽部分泌物,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,5PCR检测肺炎支原体 （PCR MP DNA）临床意义： 肺炎支原体是急性呼吸道感染和原发性非典 型肺炎的病原体。 尤其在儿童和青少年中常见。常在军营 和中小学中流行。许多患者症状较轻，大多 数不表现出任何症状，若有症状也只是头痛、 发热、咳嗽等呼吸道症状，也有个别引起死 亡的报道。 该病原体在非细菌性肺炎和非病毒性肺中 有较高的检出率。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,5PCR检测肺炎支原体 （PCR MP DNA）临床意义： 肺炎支原体除引起呼吸道感染外，还可发生 呼吸道以外的并发症，如中耳炎、心血管症 状、神经症状和皮疹等。这可能与免疫复合 物形成及抗体的出现有关。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,5PCR检测肺炎支原体 （PCR MP DNA）临床意义： 肺炎支原体感染在治疗上与其它微生物感染不尽相同，为避免滥用抗生素，早期快速、准确的检测肺炎支原体，PCR法就是有实际的临床意义和流行病学意义。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,（三）寄生虫的检测 1 PCR检测弓形虫 （PCR TOX DNA） 标本采集： 抗凝血、 羊水 脑脊液,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1 PCR检测弓形虫 （PCR TOX DNA） 临床意义： 弓形虫又称弓浆虫或毒浆虫。是一种能 寄生于造血组织中的原虫。弓形虫的滋养体形态呈新月形故名弓形体或弓形虫。 弓形虫为人畜共患的病原体，时下养猫狗等宠物之风盛行，因此也就造成了认得感染率提高。,第二节 PCR检验技术的临床应用 感染性疾病的确定诊断,1 PCR检测弓形虫 （PCR TOX DNA） 临床意义： 成人感染可因感染轻、无症状，但 血中可查到抗体。 感染重时，可引起各种症状，如高热、肌肉关节疼痛、肺炎、心肌炎或传染性单核细