培养基优化设计

1 课课 程程 设设 计计 说说 明明 书书 课程名称 新编生物工艺学 设计题目 培养基优化设计 院 系 生物与食品工程学 院 学生姓名 学 号 5 专业班级 0 8生物技 术 指导教师 关 现 军 2011 年 6 月 3 日 2 课课 程程 设设 计计 任任 务务 书书 设计题目培养基优化设计 学生姓名张学义所在院系生物院 专业 年级 班 08 生物技术 设计要求 设计要求 1 进一步巩固加深所学 生物工艺学 生物工程设备 生物工厂设计 生 物反应工程 和 发酵工艺学 等专业课程的基本理论和知识 使之系统化 综合化 2 培养学生综合运用基础理论和专业知识解决工程实际问题的能力 3 掌握有关设计手册 如 化工设备设计手册 化学工程手册 等 的使用 学生应完成的工作 学生应完成的工作 优化出培养墓营养因子最佳组成是 玉米浆 牛肉膏 乳糖 研究结果表明 嗜酸乳杆菌 嗜热链球菌 保加利亚乳杆菌 嗜酸乳酸菌 在优化后的 培养基发酵液中 培养 菌落数均高于原 培养基发酵液的菌落数 达到 护 以上 乳酸菌发酵液得到了浓缩 大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本 原料成本降低了约 0 同时使菌种数量达到最大 参考文献阅读 参考文献阅读 1 徐中儒 农业试验最优回归设计 北京 农业出版社 1988 2 贵州农学院 生物统计附试验设计 北京 农业出版社 1983 3 刘忠敏 林兴兵 杨生玉 现代应用生物技术 北京 化学工业出版社 2004 4 陶兴元 刘志国 田俊 生物工程概论 北京 化学工业出版社 2005 5 诸葛健 沈微 工业微生物育种 北京 化学工业出版社 2006 6 鲍新华 生物工程 北京 化学工业出版社 2008 工作计划 工作计划 用开始两周的时间进行课程设计的实验 包括实验设计 实验准备 实验实施 实验结果的记 录 实验的后续补充 实验全部完成后 进行课程设计的撰写 讨论实验结果 提出问题 解决问题 得出结论与探 索的新方向 完成本次课程设计 任务下达日期 2011 年 5 月 23 日 任务完成日期 2011 年 6 月 3 日 指导教师 签名 学生 签名 张学义 3 目目 录录 1 1 摘摘 要要 页码页码 2 2 关键关键 字字 页码页码 3 设计背设计背 景景 页码页码 3 1 培养基简 介 页码页码 3 2 培养基优化设计的重用意 义 页码页码 4 4 设计方设计方 案案 页码页码 4 1 原材料制 备 页码页码 4 2 菌种的选 4 择 页码页码 4 3 营养因子的比例 设 页码页码 4 4 理化条件控 制 页码 4 5 总工艺流程列 叙 页码页码 5 5 预期结预期结 果果 页码页码 6 6 方案实施时可能出现方案实施时可能出现 的问题与对的问题与对 策策 页码页码 7 7 设计感设计感 受受 页码页码 7 17 1 关于本方关于本方 案案 页码页码 7 27 2 关于自关于自 我我 页码页码 5 8 8 参考文参考文 献献 页码页码 1 1 摘要摘要 以改良 发酵培养基为墓础 选择玉米浆 牛肉膏 乳糖 番茄汁 际 蛋白陈等 个营养因子增菌培养乳酸菌进行优化 利用 8 的 7 次方 正交实 验 优化出培养墓营养因子最佳组成是 玉米浆 牛肉膏 乳糖 研究结果表明 嗜酸乳杆菌 嗜热链球菌 保加利亚乳杆菌 嗜酸乳酸菌 在优化 后的 培养基发酵液中 培养 菌落数均高于原 培养基 发酵液的菌落数 达到 护 以上 乳酸菌发酵液得到了浓缩 大大降低 了乳酸菌发酵培养墓的成本 原料成本降低了约 0 同时使菌种数量达到最大 2 关键字关键字 乳酸菌 营养因子 优化培养 最大产菌 3 3 设计背景设计背景 3 13 1 乳酸菌培养基简介乳酸菌培养基简介 乳酸菌工业产品为菌体本身细胞 因而设计出能增菌的培养基在工业上具有重要 意义 设计选用工业上佳美低廉的原料 便于降低成本 也有利于降低菌种的适应期 6 利于增值 乳酸菌增菌液配方设计中因营养要求复杂 影响生长的因素多 在实际工作中还应 做其他条件的优化 如增菌液氧化还原电势 pH 值 温度等 因工作量大而时间有限 只 能对配方作初步的优化设计 为了降低生产成本 在工业应用时可选用乳清和脱脂乳经 蛋白酶水解 用以提高增菌效果 再加入乳糖 啤酒酵母的自溶水解物 在发酵罐内完成 乳酸菌的增菌 罐内可以通入过滤除菌的 N2和 CO2 以降低反应液氧化还原电势 特别 是保加利亚乳杆菌 若有自动化发酵罐还可通过监测 pH 值 发酵罐自动注入灭菌的1 mol 1NaOH 或 NH4OH 液 以中和代谢乳酸 培养基 Medium 是供微生物 植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养 料 一般都含有碳水化合物 含氮物质 无机盐 包括微量元素 以及维生素和水等 有的培养基还含有抗菌素和色素 用于单种微生物培养和鉴定 培养基由于配制的原料不同 使用要求不同 而贮存保管方面也稍有不同 一 般培养基在受热 吸潮后 易被细菌污染或分解变质 因此一般培养基必须防潮 避 光 阴凉处保存 对一些需严格灭菌的培养基 如组织培养基 较长时间的贮存 必 须放在2 6 的冰箱内 由于液体培养基不易长期保管 现在均改制成粉末 化学分类 天天然然培培养养基基 指一类利用动 植物或微生物体包括其提取物制成的培 养基 如牛肉膏蛋白胨培养基 麦芽汁培养基等 组组合合培培养养基基 又称为合成培养基 或综合培养基 是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的 培养基 如葡萄糖铵盐培养基 淀粉硝酸盐培养基等 半半组组合合培培养养基基 指一类主 要以化学试剂配制 同时还加有某种或某些天然成分的培养基 例如 马铃薯蔗糖培 养基 物物理理分分类类 液液体体培培养养基基 一类呈液态的培养基 固固体体培培养养基基 一类外观呈固 态的培养基 根据性质又分为固化培养基 非可逆性固化培养基 天然固态培养基 滤膜 半半固固体体培培养养基基 指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状 态的培养基 脱脱水水培培养养基基 又称预制干燥培养基 指含有除水分外的一切成分的 商品培养基 微微生生物物分分类类 选择性培养基 一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学 物理因素的抗性而设计的培养基 具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能 广 泛用于菌种筛选等领域 鉴别培养基 一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢 产物发生显色反应的指示剂 从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中 找出目的菌菌落的培养基 例如 伊红美蓝乳糖培养基 EMB 另外一种就是天然培养基 天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的 一类培养基 如血浆 血清 淋巴液 鸡胚浸出液等 组织培养技术建立早期 体外 培养细胞都是利用天然培养基 但是由于天然培养基制作过程复杂 批间差异大 因 此逐渐为合成培养基所替代 目前广泛使用的天然培养基是血清 另外各种组织提取 液 促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少 3 2存在问题 7 目前的培养基虽能进行乳酸菌生产 但是 其有操作复杂 产量小 资源浪费 成本过高等不足之处 3 33 3 培养基优化设计的重用意义 合理配置的培养基中各种营养物质成分达到最适比例 PH 达到最适 溶解氧也达 到了最适浓度 这样就给微生物创造了最适宜生长的环境条件 并且对环境产生的污 染降到最低 实现了资源的循环利用 又能单位时间内生长最多的菌量 同时减少了 动力设备与加压设备 大大减少了成本 这对于一个生产企业来说无疑意义重大 4 4 设计方案设计方案 4 14 1 原材料制备原材料制备 41 1 菌种 嗜热链球菌 保加利亚乳杆菌及其混合菌 4 1 2 电子天平 酸度计 培养箱 电热恒温水浴锅 高压灭菌锅 放大镜 冰 箱 4 1 3 玻璃仪器 试管 三角烧瓶 试剂瓶 刻度吸管 平皿等 4 1 4 实验室试剂 浓度为 1mol L 的 NaOH 体积分数为 75 的乙醇 M17 合 成培养基 酸化 MRS 培养基 质量分数为 10 脱脂乳液的配制 取 150g 脱脂奶粉 加入 1350mL 的蒸馏水中 配成 10 的脱脂乳液 备用 4 24 2 菌种的选择菌种的选择 4 2 1 酸奶的特征微生物菌落计数 9 及菌落形态将样品以十进制稀释后 取适当 的稀释度分别接种 应用选择性培养基倒平板 MRS 培养基 在 37 下培养 72h 计 算其保加利亚乳杆菌的菌落数 M17 培养基 在 37 下培养 48h 计算其嗜热链球菌 的菌落数 4 2 2 绘制球菌和杆菌及混合菌的发酵曲线 取已知含嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌菌量的牛 乳 在相同的温度下 各取 1 种单独培养 同时也使 2 种菌按一定的比例混合后培养 随着时间的变化分别测定其 酸度值 然后绘制曲线 其操作步骤如下 1 取质量分数 10 的脱脂乳液 600mL 分装于 3 个烧瓶中 每个烧瓶装入 200mL 于 105 下高温蒸汽灭菌 15min 2 无菌室 超净台 中的分别接种 取装有接种菌种牛乳的试管 摇匀里面的 牛乳 用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳 1mL 注入 1 个烧瓶中 用吸管吸取含保加利 亚乳杆菌的牛乳 10mL 注入第 2 个烧 瓶中 然后 用吸管吸取含嗜热链球菌的牛乳 8 0 5mL 同时用吸管吸取含保加利亚乳杆菌的牛乳 5mL 一起注入第 3 个烧瓶中 并均 编号 3 将 3 个烧瓶密封 充分振摇 然后将其都放在 42 的培养箱中恒温培养 每 隔 30min 测定 1 次 3 个烧瓶中牛乳的酸度 做出其酸度随时间变化的曲线 测定酸牛乳的酸度 吉尔涅尔度 取 10mL 酸牛乳 用 20mL 的蒸馏水稀释 加入 0 5mL 体积 分数为 0 5 的酒精性酚酞 指示剂 以浓度 0 1mol L 的 NaOH 滴定 将消耗的 NaOH 体积 mL 数乘以 10 即 每 100mL 牛乳中所需要的浓度为 0 1mol L 的 NaOH 的毫升数为 1 T 称为 1 吉尔涅 尔度 一般牛乳的酸度超过 20 T 即可认为该牛乳已开始变酸 酸度越高 对热的 稳定性越差 越易凝固 由图 1 可得知 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌单独作为发酵剂时 它们在开始阶段的 发酵速度比混合菌的快 其中 嗜热链球菌的发酵速度又较保加利亚乳杆菌快 随着 发酵时间的延长 嗜热链球菌的发酵 速度开始减小 保加利亚乳杆菌的发酵的速度也 开始减小 但混合菌的发酵速度逐渐加大 并且在 2h 后混合菌发酵牛乳的酸度分别超 过杆菌的和球菌的 酸度明显提高 12h 后 其酸度远远超过单菌的 品尝酸奶时 发 现混合菌发酵的酸奶口感更好 有一上可知混合菌的发酵条件比单菌的更好更有价值 但如何搭配这两种菌使其得到 更加优化的乳酸菌呢 现就设计不同比例的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的发酵条件 来得出使乳酸菌增菌的最佳混合菌的比例 绘制不同比例的混合菌发酵曲线 将菌种混合后 在相同的温度下培养 测定菌种的比例 并随着时间的变化分别测定 其酸度值 然后 绘制曲线 具体操作步骤如下 1 取配制好且灭菌的质量分数 10 的脱脂牛乳 1000mL 分装于 5 个烧瓶 每瓶 200mL 分别接种 第 1 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳 0 75mL 和含保加利亚乳杆 9 菌的牛乳 2 5mL 第 2 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳 0 5mL 和含保加利亚乳杆菌 的牛乳 5mL 第 3 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳 0 8 mL 和含保加利亚乳杆菌的牛 乳 2mL 第 4 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳 0 25mL 和含保加利亚乳杆菌的牛乳 7 5mL 第 5 个烧瓶中注入含嗜热链球菌的牛乳 0 6mL 和含保加利亚乳杆菌的牛乳 4mL 分别标注发酵剂 1 号 5 号 2 取接种牛乳的 5 个烧瓶 每瓶中分别倒出 50mL 于另一烧瓶中 编上号 培养前 取装混合菌的 5 个烧瓶中的牛乳 用酸奶的特 征微生物菌落计数 法记数 将接种的 5 瓶牛乳密封后 放在 43 的恒温培养箱里面培 养 将另 5 个烧瓶盖上塞子后 置于 43 的水浴锅中 每 5min 测定 5 个烧瓶里牛乳 的酸度值 3 待到水浴锅中的烧瓶中的牛乳出现凝聚时 将恒温箱中对应的烧瓶取 出 测定其酸度 之后置于 4 的冰箱中储存 将菌种 1 和菌种 2 每隔一段时间从冰箱 中取出后 倒出 30mL 测定其酸度 然后放回冰箱中继续储存 4 34 3 营养因子的比例设计 结果 不同营养因子对嗜酸乳杆菌生长关系影响大小顺序为 玉米浆 马铃薯汁 牛肉膏 乳糖 际蛋白陈 葡萄糖 番茄汁 帕拉金糖 1 3 正交试验 培养基中共取 个营养因子 牛肉膏 乳糖 番茄汁 马铃薯汁 葡萄糖 玉 米浆 际蛋白胨 采用 个因子 个位级的正交表 8 的 7 次方 设计试验 接种嗜酸乳 杆菌采用二级发酵试验由 个因子的 值 得出它们作用的主次顺序为 玉米浆 牛肉膏 乳糖 际蛋白陈 马铃薯汁 番茄汁 葡萄糖 分析得到下表 10 利用正交试验所优化培养基组成 即 玉米浆 牛肉膏 乳糖 加其他盐 进步用 种乳酸菌进行发酵试验 验证培养基的发酵增菌效果并与 培养基进行比较 分别接种 种乳酸菌 7 发酵培养 0 用平板计数 法 无氧培养 进行 检测 均进行 次发酵 测定发酵液菌落数 结果见表 4 44 4 理化条件的控制理化条件的控制 1 温度 温度是影响微生物生长的最重要因素之一 从微生物整体来看 生长的温度范 围一般在 10 100 极端下限为 30 极端上限为 105 300 微生物不同生理活动 要求不同温度 所以 最适生长温度 发酵速度快 积累代谢产物多 一般而言 老龄比幼龄耐热 原核生物比真核生物耐热 非光合生物比光合生 物耐热 结构简单的比结构复杂的耐热 在富含蛋白质的培养基上生长的细菌耐热能 力强 最适温度是一种相对概念 是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成 选择最适温度应该考虑微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度 最适发酵温度 11 与菌种 培养基成分 培养条件和菌体生长阶段有关 在各种微生物的培养过程中 各个发酵阶段的最适温度的选择是从各方面综合进行考虑确定的 例如 在四环素发 酵中 采用变温控制 在中后期保持较低的温度 以延长抗生素分泌期 放罐前 24h 提高 2 3 培养 能使最后 24h 的发酵单位提高 50 以上 又如 青霉素发酵最初 5h 维持 30 6 35h 为 25 36 85h 为 20 最后 40h 再升到 25 采用这种变温培养 比 25 恒温培养的青霉素产量提高 14 7 2 pH 值的影响 微生物的生长 pH 值范围极广 从 pH8 都有微生物能生长 但是绝大多数种类 都生活在 pH5 0 9 0 之间 同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程 中 对 pH 值的要求也不同 在发酵工业中 控制 pH 值尤其重要 同一种微生物在不同 的生长阶段和不同生理生化过程中 对环境 pH 值要求不同 微生物生长最适 pH 与产物形成最适 pH 相互关系的四种情况 第一种情况是菌体 的比生长速率 和产物的比生产速率 Qp 都有一个相似的并且较宽的最适 pH 范围 第二种是 Qp 或 的最适 pH 范围很窄 而 或 Qp 的范围较宽 第三种是 和 Qp 有 相同的最适 pH 范围 但范围很窄 即对 pH 值的变化敏感 第四种 和 Qp 都有各 自的最适 pH 范围 属于第一种情况的发酵过程比较易于控制 第二 三模式的发酵 pH 须要严格控制 最后一种情况应该分别严格控制各自的最适 pH 选择最适 pH 的原则是既有利于菌体的生长繁殖 又可以最大限度地获得高的产量 一般最适 pH 是根据实验结果来确定的 通常将发酵培养基调节成不同的起始 pH 值 在发酵过程中定时测定 并不断调节 pH 以维持其起始 pH 值 或者利用缓冲剂来维 持发酵液的 pH 同时观察菌体的生长情况 菌体生长达到最大值的 pH 即为菌体生长 的最适 pH 产物形成的最适 pH 也可以如此测得 只有在最适 pH 下菌种才能生长才 能达到最大菌种产量 3 溶解氧的影响 溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一 由于氧在水中的溶解度很小 在发酵液 中的溶解度亦如此 因此 需要不断通风和搅拌 才能满足不同发酵过程对氧的需求 溶氧的大小对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响 如谷氨酸发酵 供 氧不足时 谷氨酸积累就会明显降低 产生大量乳酸和琥珀酸 需氧发酵并不是溶氧愈大愈好 溶氧高虽然有利于菌体生长和产物合成 但溶氧 太大有时反而抑制产物的形成 因为 为避免发酵处于限氧条件下 需要考查每一种 发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度 并使发酵过程保持在最适浓度 最适溶氧浓度 的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关 这是由实验来确定的 4 54 5 总工艺流程列叙总工艺流程列叙 工艺流程 培养嗜热链球菌 保加利亚乳杆菌 对数期接种 将菌种放在 MRS 培 养基培养 接种在三个烧瓶里中 改变营养因子条件 改变理化控制条件 37 C 下 培养 72 小时 无菌室中接种 分装试管中 分别滴加含嗜热链球菌的牛乳 1mL 编号 密封 测定菌种含量 比较方差分析 得到最产量最大的培养基配方与理化条件 5 预期结果 12 结果表明优化后的培养基利用的营养因子为 玉米浆 牛肉膏 乳糖 原 培养基的营养因子配比为 蛋白陈 牛肉膏 乳糖 葡萄糖 番茄汁 其中际蛋白陈价格昂贵 零售价格约 元 而优化后培养基的主要营养因子为玉米浆其为生产玉米蛋白的副产品 价格低廉 价 格约 一 元 kg 进行酸处理后成本也不过 一 元 因此 优化后的 培养基成本降低约 大大降低了成本 研究结果表明 嗜酸乳杆菌 嗜热 链球菌 保加利亚乳杆菌 嗜酸乳酸菌 在优化后的 培养基发酵液中 培养 菌落数均高于原 培养基发酵液的菌落数 达到 护 以 上 乳酸菌发酵液得到了浓缩 大大降低了乳酸菌发酵培养墓的成本 原料成本降低 了约 0 同时使菌种数量达到最大 6 6 方案实施时可能出现的问题与对策方案实施时可能出现的问题与对策 1 配料的 R 值因子 是影响乳酸菌生长浓度的主要因素 2 微生物的生长 pH 值范围极广 从 pH8 都有微生物能生长 但是绝大多 数种类都生活在 pH5 0 9 0 之间 7 7 设计感受设计感受 7 1 7 1 关于本方案关于本方案 通过正交试验优化了乳酸菌发酵培养基 用价格低廉的原料 如玉米浆等 代替了价 格昂贵的原料 如