免疫组化方法和步骤

威斯腾生物 400 675 6758 免疫组化检测免疫组化检测 CD34 的表达的表达 1 1 基本原理基本原理 免疫组化 是应用免疫学基本原理 抗原抗体反应 即抗原与抗体特异性结合的原 理 通过化学反应使标记抗体的显色剂 荧光素 酶 金属离子 同位素 显色来确定组 织细胞内抗原 多肽和蛋白质 对其进行定位 定性及定量的研究 称为免疫组织化学技 术 immunohistochemistry 或免疫细胞化学技术 immunocytochemistry 威斯腾生物威斯腾生物 400 675 6758400 675 6758 1 1 PBS pH 7 4 2 5L 20 0157g 137mM NaCl 0 g 2 68mM KCl 0 g 1 47mM KH2PO4 7 g 8 1mM Na2HPO4 115 15 min 2 0 85 NaCl 500 ml 4 25 g Nacl 500 ml 三蒸水 115 15 min 3 4 多聚甲醛 500 ml 20 g 多聚甲醛 500 ml PBS 在 65 水箱中 3 h 多 再放入 4 保存 4 DNase I buffer 40 mM Tris HCl pH 7 9 10 mM NaCl 6 mM MgCl2 10 mM CaCl2 5 Proteinase K buffer 100 mM Tris HCl pH 8 0 50 mM EDTA 6 DNase 1 原液 1000 U ml 按 1 99DNase 1 缓冲液稀释至 10 U ml 7 DAB 工作液 临用前配制 5ul 20 DAB 1ul 30 H2O2 94 ul PBS 8 20 g ml Proteinase K 工作液 按 1 500 稀释贮存液 1 mg ml 威斯腾生物 400 675 6758 9 另外 双蒸水 无菌 0 85 NaCl 二甲苯 梯度乙醇 100 95 85 70 50 苏木素 2 2 主要仪器设备主要仪器设备 电热压力蒸汽消毒器 XDD 浙江绍兴医疗器械总厂 超净工作台 苏州净化设备公司 TC2323 型 CO2恒温孵箱 美国 SHEL LAB 公司 恒温烤箱 上海跃进医疗器械厂 高速台式离心机 BACKMAN CS 15R 美国 Beckman 公司 抽滤器 AUTOSCIENCE AP 01 上海 磁力搅拌器 79 1 江苏江阴科研器械厂 0 22um 纤维素滤膜 德国 BM 公司 0 45um 混合纤维素滤膜 德国 BM 公司 1 10000 电子天枰 Sartorius AC 211 德国 细胞培养瓶及细胞培养板 Costar 美国 细胞计数板上海医用仪器厂 光学显微镜 OLYMPUS CK 40 日本 倒置显微镜 OLYMPUS 日本 照像系统 OLYMPUS BH 2 日本 切片机 德国 Leica 展片机 德国 Leica HI1210 型 烤片机 德国 Leica HI1220 型 3 实验方法实验方法 3 1 载玻片的处理 抗原修复过程中 由于高温 高压 辐射等诸多因素的影响 极易造成脱片 1 APES 现用现配 将洗净的玻片放入以 1 50 比例丙酮稀释的 APES 中 停留 20 30 秒 钟 取出稍停片刻 再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的 APES 置通风橱中晾干即 可 用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位 并尽量减少气泡的存在 以免影响染色结 果 2 HistogripTM 将洗净的玻片放入以 1 50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中 停留 1 2 分钟 威斯腾生物 400 675 6758 然后用双蒸水快速清洗三次 室温干燥或 60oC 烤箱烘烤一小时 装盒备用 3 Poly L Lysine 将洗净 干燥的载玻片放入以 1 10 比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液 中 浸泡 5 分钟 60oC 烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥 装盒备用 试验中使用的器具均 为非玻璃制品 3 2 常用酶消化 1 胰蛋白酶 一般使用浓度为 0 05 0 1 消化时间为 37 10 40 分钟 主要用于细 胞内抗原的显示 2 胃蛋白酶 一般使用浓度为 0 4 消化时间为 37 30 180 分钟 主要用于细胞间 质抗原的显示 如 Laminin 层粘蛋白 Collagen IV IV 型胶原 等 3 皂素 Saponin 一般使用浓度为 2 10 g ml 的 saponin 溶液 消化时间为室温孵育 30 分钟 3 3 抗原热修复 可根据实验室的具体条件 选用微波炉抗原修复 高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复 抗原热修复可选用各种缓冲液 如 TBS PBS 重金属盐溶液等 但实验证明 以 0 01M 枸橼酸盐缓冲液 pH6 0 效果最好 3 3 1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法 切片脱蜡至水后 3 H2O2 处理 10 分钟 蒸馏 水洗 2 分钟 3 将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液 工作液 的容器中 置微波炉内加热使 容器内液体温度保持在 92 98 之间并持续 10 15 分钟 注意 无论是使用医用或家用 微波炉 请根据具体机型酌情设置条件 务必满足以上步骤中对温度和时间的要求 取出 容器 室温冷却 10 20 分钟 注意 不可将切片从缓冲液中取出冷却 以便使蛋白能够恢 复原有的空间构型 PBS 洗 下接免疫组化染色步骤 3 3 2 石蜡切片高压抗原修复操作方法 切片脱蜡至水 将 1500ml 3000ml 的枸橼酸盐缓 冲液 工作液 注入不锈钢压力锅中加热至沸腾 切片置于金属架上 放入锅内 使切片 位于液面以下 盖锅压阀 当压力锅开始慢慢喷气时 约加热 5 6 分钟后 计时 1 2 分 钟 然后将压力锅端离热源 冷水冲至室温后 取下气阀 打开锅盖 取出切片 蒸馏水 洗后 PBS 洗 2 分钟 3 下接免疫组化染色步骤 3 3 3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法 切片脱蜡至水后 放入盛有枸橼酸盐缓冲液 工作液 的容器中 并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中 电炉上加热煮沸 从小容器的温度到达 92 98 起开始计时 15 20 分钟 然后端离电炉 室温冷却 20 30 分钟 蒸馏水冲洗 PBS 洗 下接免疫组化染色步骤 3 3 免疫组化染色步骤 1 石蜡切片脱蜡 100 二甲苯 10minX 2 50 二甲苯 5min 威斯腾生物 400 675 6758 2 复水 无水乙醇 5minX 2 95 乙醇 5min 90 乙醇 5min 80 乙醇 5min 70 乙醇 5min 蒸馏水洗涤 5min 3 3 H2O2 室温孵育 15 分钟 以消除内源性过氧化物酶的活性 4 PBS 浸泡 5 分钟 3 次 5 抗原修复 加入 0 2 Triton X 100 室温下 4 分钟 弃去液体 0 5 Triton X 100 室温 下 10 分钟 PBS 冲洗 5 分钟 3 次 6 6 正常山羊血清 PBS 稀释 封闭 室温孵育 20 分钟 倾去血清 勿洗 滴加适当比 例稀释的一抗或一抗工作液 37 孵育 1 2 小时或 4 过夜 7 PBS 浸泡 5 分钟 3 次 8 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗 1 BSA PBS 稀释 37 孵育 30 分钟 或滴加 第二代生物素标记二抗工作液 37 或室温孵育 30 分钟 9 PBS 冲洗 5 分钟 3 次 10 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素 PBS 稀释 37 孵育 10 30 分钟 或 第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液 37