琼脂糖凝胶电泳1

1 DNADNA 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 跑胶即走电泳 是 DNA 和 protein 最基本的定性定量方法 一般是琼脂糖胶或 page 胶 琼脂糖胶一般是检测 DNA 的 可以检验一下你到底提到 dna 没过确定你提 dna 分子 量的大小 page 胶一般是检测蛋白特性的 通过 page 胶里 marker 的分子量大小来确定 你需要的目的蛋白分子量大小 如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带 如 果想知道蛋白浓度 还可以在 page 胶里带上一条定量 marker 通过条带粗细 来判断你 需要蛋白的浓度 二者原理一致 小分子量用大浓度的胶 大分子量用小浓度的胶 特别 小的 DNA 用丙烯酰胺凝胶 一 一 基本原理基本原理 当把一个带净电荷 q 的颗粒放入电场 便有一个电场力 F 作用于其 上 F 的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度 E 它们之间的关 系可以表示成 F E q 由于 F 的作用 使带电颗粒在电场中向一定方向泳动 此颗粒在泳动的过 程中还受到一个相反方向的摩擦力 f v 阻挡 当这两种力相等时 颗粒则 以速度 v 向前泳动 v F f 其中 f 为摩擦系数 根据 Stoke 公式 阻力大 小取决于带电颗粒的大小 形状以及所处介质的粘度 即 f 6 为颗粒半径 为介质粘度 该公式指球形颗粒所受的阻力 代入 F E q 得到 v E q 6 从这个公式可以看出 带电颗粒在电场中 泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比 与颗粒半径和介质 粘度成反比 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度 m 或者迁移率以下列公式表示 m E d l V t d 为带电颗粒泳动的距离 cm l 为支持物的有效长度 cm t 为通电 时间 s V 为加在支持物两端的电压 在一定条件下 任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度 它是胶体颗 粒的一个物理常数 可用其鉴定蛋白质 核酸等物质的纯度 还可以用其 来研究蛋白质 核酸等物质的一些理化性质 影响泳动度的因子有颗粒的 性质 电场强度 溶液的性质等 二 二 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 通常情况下 核酸类物质的分离 鉴定是采用琼脂糖凝胶 做支持物 电泳法进行的 用琼脂糖分离线性 DNA 时 其迁移率与该物质分子质量的 关系密切 而与结构和碱基组成无关 这也是采用凝胶电泳法测定核酸分 子质量的依据所在 此方法除了可以分离线性 DNA 外 还可以分离 分析 细菌质粒的闭环 DNA 和开环 DNA 以及分子质量不等的 RNA 片段 一般实验 室采用的琼脂糖凝胶的浓度为 0 3 2 不同的凝胶浓度 可以分离不 同长度的 DNA 片段 具体见表格 琼脂糖凝胶 m V分离线性 DNA 片段的范围 kb 0 350 60 0 61 20 0 70 8 10 0 90 5 7 0 1 20 4 6 0 2 1 50 3 3 0 2 00 1 2 0 琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液 缓冲液 pH 1 50mmol LTris NaH2PO4 1 5mmol L EDTA7 5 8 0 2 50mmol LNaH2PO4 Na2HPO4 1 5mmol L EDTA7 5 8 0 3 50mmol L Tris 乙酸 1 5mmol L EDTA 7 5 8 0 4 50mmol L 乙酸钠 乙酸 1 5mmol L EDTA 7 5 8 0 5 89mmol LTris H3BO3 1 5mmol L EDTA8 3 琼脂糖凝胶电泳常用的样品缓冲液 示踪染料 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯 青 FF 30 甘油水溶液 并且这两种指示剂在琼脂糖凝胶中的迁移率不同 可以指示一定片段长度的 DNA 迁移率 具体见下表 琼脂糖凝胶浓度溴酚蓝二甲苯青 0 6 1kb 1 0 0 6kb2kb 1 4 0 2kb1 6kb 2 0 0 15kb 核酸分子量标准 Marker DNA 电泳一定要用 DNA Marker 或者是已知大小的正 对照 DNA 来估计片段的大小 应该选择在目标片段大小附近 Ladder 较密的 Marker 这样对于目标片段大小的估计才比较准确 核酸电泳染色剂 核酸电泳以后 需要经过染色才能显现带型 最常用的染色 剂是溴化乙锭 EB 其次是银染法 1 溴化乙锭 ethidium bromide 一种荧光染料 可以嵌入核酸的双链碱基对 之间 在紫外光线的激发下 发出红色荧光 2 银染法 染色液中的银离子可与核酸形成稳定的复合物 然后用还原剂如甲 醛使银离子还原成银颗粒 可以将核酸带染成黑色 灵敏度比 EB 高 但是 DNA 不易回收 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下 1 制备 1 琼脂糖凝胶 大胶用 70ml 小胶用 50ml 称取 0 7 g 0 5 g 琼脂 糖置于锥形瓶中 加入 70 ml 50ml 1 TAE 瓶口倒扣小烧杯 微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化 摇匀 即成 1 0 琼脂糖凝胶液 2 胶板制备 取电泳槽内的有机玻璃内槽 制胶槽 洗干净 晾干 放入制胶玻 璃板 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 形成模子 将内槽置于水平 位置 并在固定位置放好梳子 将冷却到 65 左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地 倒入内槽玻璃板上 使胶液缓慢展开 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 室 温下静置直至凝胶完全凝固 垂直轻拔梳子 取下胶带 将凝胶及内槽放入电 泳槽中 添加 1 TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止 3 3 加样 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液 上样缓冲液的 最终稀释倍数应不小于 1X 用 10 ul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品 小槽内 每加完一个样品 应更换一个加样头 以防污染 加样时勿碰坏样品孔 周围的凝胶面 注意 加样前要先记下加样的顺序 4 电泳 加样后的凝胶板立即通电进行电泳 电压 60 100V 样品由负极 黑色 向 正极 红色 方向移动 电压升高 琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 当溴酚蓝 移动到距离胶板下沿约 1cm 处时 停止电泳 5 电泳完毕后 取出凝胶 用含有 0 5 ug ml 的溴化乙锭 1 TAE 溶液染色约 20 min 再用清水漂洗 10 min 6 观察照相 在紫外灯下观察 DNA 存在则显示出红色荧光条带 采用凝胶成 像系统拍照保存 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 一一 实验原理实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNADNA 片段的常用技术片段的常用技术 把把 DNADNA 样品加入到一块包样品加入到一块包 含电解质的多孔支持介质含电解质的多孔支持介质 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 的样品孔中的样品孔中 并置于静电场上并置于静电场上 由于由于 DNADNA 分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基 因此在电场中向正极移动因此在电场中向正极移动 在一定的电场强度下在一定的电场强度下 DNA DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应分子的迁移速度取决于分子筛效应 具有不同的相对具有不同的相对 分子质量的分子质量的 DNADNA 片段泳动速度不一样片段泳动速度不一样 因而可依据因而可依据 DNADNA 分子的大小来使其分离分子的大小来使其分离 凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的 DNA DNA 也可以分离相对分子质量相同也可以分离相对分子质量相同 而构而构 型不同的型不同的 DNADNA 分子分子 在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物 和样品一起进行电泳而得到检测和样品一起进行电泳而得到检测 相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用 于确定于确定 DNADNA 片段大小的标准片段大小的标准 在凝胶中加入少量溴化乙锭在凝胶中加入少量溴化乙锭 ethidium ethidium bromide bromide EB EB 其分子可插入其分子可插入 DNADNA 的碱基之间的碱基之间 形成一种络合物形成一种络合物 在在 254254 365nm365nm 波长紫外光波长紫外光 照射下照射下 呈桔红色荧光呈桔红色荧光 因此也可对分离的因此也可对分离的 DNADNA 进行检测进行检测 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在 0 2kb0 2kb 50kb50kb 范围内的范围内的 DNADNA 片段片段 本实验介绍本实验介绍 琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在 DNADNA 片段分离中的应用方法片段分离中的应用方法 琼脂糖凝胶浓度 琼脂糖凝胶浓度 线状线状 DNADNA 分子分离范围 分子分离范围 kbkb 0 30 3 5 605 60 0 60 6 1 201 20 0 90 9 0 5 70 5 7 1 21 2 0 4 60 4 6 1 51 5 0 2 30 2 3 2 02 0 0 1 20 1 2 4 琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法 根据琼脂糖的溶解温度 琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法 根据琼脂糖的溶解温度 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖的熔点为把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖的熔点为 62 65 62 65 溶溶 解后在解后在 3737 下维持液体状态约数小时下维持液体状态约数小时 主要用于主要用于 DNADNA 片断的回收 质粒与外源性片断的回收 质粒与外源性 DNADNA 的快速连接等 的快速连接等 DNADNA 在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度 在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度 DNADNA 分子量及其构象 电泳缓冲分子量及其构象 电泳缓冲 液 电场强度等因素有关 一般说来 液 电场强度等因素有关 一般说来 DNADNA 片断越大或者琼脂糖浓度越大 其片断越大或者琼脂糖浓度越大 其 迁移速率越大 而电场强度越高 其迁移速率越大 不同浓度琼脂糖凝胶迁移速率越大 而电场强度越高 其迁移速率越大 不同浓度琼脂糖凝胶 DNADNA 分离范围见上图表 分离范围见上图表 二二 仪器及试剂仪器及试剂 1 1 仪器及耗材仪器及耗材 水平电泳槽水平电泳槽 电泳仪电泳仪 凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统 微波炉微波炉 微量移液器微量移液器 透明胶带透明胶带 点样或点样或 parafilm 100parafilm 100 mlml 或或 250250 mlml 锥形瓶锥形瓶 量筒量筒 吸头等吸头等 2 2 试剂及配制试剂及配制 50 TAE50 TAE 缓冲液的配制缓冲液的配制 2 2 mol Lmol L Tris Tris 乙酸乙酸 0 05 0 05 mol Lmol L EDTA pHEDTA pH 8 0 8 0 配制配制 10001000 mlml TrisTris 242242 g g 冰乙酸冰乙酸 57 157 1 mlml 0 50 5 mol Lmol L EDTAEDTA 100100 mlml 加入加入 600600 mlml 去离子水后搅拌溶解去离子水后搅拌溶解 将溶液定容至将溶液定容至 1 1 L L 后后 高温高压灭菌高温高压灭菌 室温保室温保 存存 1 TAE1 TAE 缓冲液的配制缓冲液的配制 称量称量 2020 mlml 的的 50 TAE50 TAE 缓冲液缓冲液 再加入再加入 980980 mlml 的去离子水的去离子水 溴化乙啶贮存液溴化乙啶贮存液 10 10 mg mlmg ml 溴化乙啶溴化乙啶 配制配制 100 100 mlml 称取称取 1 1 g g 溴化乙啶溴化乙啶 置于置于 100100 mlml 烧杯中烧杯中 加入加入 8080 mlml 去离子水后搅拌溶解去离子水后搅拌溶解 将溶将溶 液定容至液定容至 100100 mlml 后后 转移到棕色瓶中转移到棕色瓶中 室温保存室温保存 6 6 上样缓冲液上样缓冲液 0 25 0 25 溴酚蓝溴酚蓝 0 25 0 25 二甲苯青二甲苯青 FF 30 FF 30 甘油甘油 配制配制 10 10 mlml 溴酚蓝溴酚蓝 2525 mgmg 5 二甲苯青二甲苯青 FFFF 2525 mgmg 甘油甘油 3 3 mlml 用用 6 TAE6 TAE 缓冲液定溶至缓冲液定溶至 1010 ml ml 分装成分装成 1 1 ml ml 管管 20 20 保存保存 其它试剂其它试剂 DNA DNA 样品样品 DNA DNA LadderLadder 琼脂糖琼脂糖 三三 操作步骤操作步骤 1 1 制备制备 1 1 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 大胶用大胶用 70ml 70ml 小胶用小胶用 50ml 50ml 称取称取 0 70 7 g 0 5g 0 5 g g 琼脂糖置琼脂糖置 于锥形瓶中于锥形瓶中 加入加入 7070 ml 50ml 1 TAE ml 50ml 1 TAE 瓶口倒扣小烧杯瓶口倒扣小烧杯 微波炉加热煮沸微波炉加热煮沸 3 3 次至次至 琼脂糖全部融化琼脂糖全部融化 摇匀摇匀 即成即成 1 0 1 0 琼脂糖凝胶液琼脂糖凝胶液 2 2 胶板制备胶板制备 取电泳槽内的有机玻璃内槽取电泳槽内的有机玻璃内槽 制胶槽制胶槽 洗干净洗干净 晾干晾干 放入制胶玻璃放入制胶玻璃 板板 取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好 形成模子形成模子 将内槽置于水平位置将内槽置于水平位置 并在固定位置放好梳子并在固定位置放好梳子 将冷却到将冷却到 65 65 左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内 槽玻璃板上槽玻璃板上 使胶液缓慢展开使胶液缓慢展开 直到整个玻璃板表面形成均匀胶层直到整个玻璃板表面形成均匀胶层 室温下静置直室温下静置直 至凝胶完全凝固至凝胶完全凝固 垂直轻拔梳子垂直轻拔梳子 取下胶带取下胶带 将凝胶及内槽放入电泳槽中将凝胶及内槽放入电泳槽中 添加添加 1 TAE1 TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止电泳缓冲液至没过胶板为止 3 3 加样加样 在点样板或在点样板或 parafilmparafilm 上混合上混合 DNADNA 样品和上样缓冲液样品和上样缓冲液 上样缓冲液的最上样缓冲液的最 终稀释倍数应不小于终稀释倍数应不小于 1X 1X 用用 1010 ulul 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽 内内 每加完一个样品每加完一个样品 应更换一个加样头应更换一个加样头 以防污染以防污染 加样时勿碰坏样品孔周围的加样时勿碰坏样品孔周围的 凝胶面凝胶面 注意注意 加样前要先记下加样的顺序加样前要先记下加样的顺序 4 4 电泳电泳 加样后的凝胶板立即通电进行电泳加样后的凝胶板立即通电进行电泳 电压电压 60 100V 60 100V 样品由负极样品由负极 黑色黑色 向正极向正极 红色红色 方向移动方向移动 电压升高电压升高 琼脂糖凝胶的有效分离范围降低琼脂糖凝胶的有效分离范围降低 当溴酚蓝移当溴酚蓝移 动到距离胶板下沿约动到距离胶板下沿约 1cm1cm 处时处时 停止电泳停止电泳 5 5 电泳完毕后电泳完毕后 取出凝胶取出凝胶 用含有用含有 0 50 5 ug mlug ml 的溴化乙锭的溴化乙锭 1 TAE1 TAE 溶液染色约溶液染色约 2020 min min 再用清水漂洗再用清水漂洗 1010 min min 6 6 观察照相观察照相 在紫外灯下观察在紫外灯下观察 DNA DNA 存在则显示出红色荧光条带存在则显示出红色荧光条带 采用凝胶成像采用凝胶成像 系统拍照保存系统拍照保存 四四 常见问题及注意事项常见问题及注意事项 1 1 配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶 2 2 琼脂糖凝胶易于破碎琼脂糖凝胶易于破碎 操作时要轻缓操作时要轻缓 3 3 电泳时应注意电源线路电泳时应注意电源线路 预防触电预防触电 4 4 溴化乙淀具有致癌作用溴化乙淀具有致癌作用 配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套 并在专门并在专门 的实验室内使用的实验室内使用 5 5 紫外线对人体有损伤作用紫外线对人体有损伤作用 开灯时间不宜太长开灯时间不宜太长 注意防护注意防护 6 DNA6 DNA 带形状模糊带形状模糊 DNA DNA 加样过多加样过多 电压太高电压太高 凝胶中有气泡凝胶中有气泡 7 7 质粒质粒 DNADNA 的存在形式有的存在形式有 3 3 种种 共价闭环共价闭环 DNA cccDNA DNA cccDNA 常以超螺旋形式存在常以超螺旋形式存在 开环开环 DNA ocDNA DNA ocDNA 此种质粒此种质粒 DNADNA 的两条链中有一条发生一处或多处断裂的两条链中有一条发生一处或多处断裂 因此因此 可以自由旋转从而消除张力可以自由旋转从而消除张力 形成松弛的环状分子形成松弛的环状分子 线状线状 DNA DNA 因质粒因质粒 DNADNA 的两的两 条链在同一处断裂而造成条链在同一处断裂而造成 因此质粒因此质粒 DNADNA 电泳的结果中有可能出现三条泳带电泳的结果中有可能出现三条泳带 它它 6 们的泳动速度为们的泳动速度为 cccDNA cccDNA 线状线状 DNADNA ocDNA ocDNA 添加来自添加来自 TIANGENTIANGEN 的资料的资料 1 1 琼脂糖琼脂糖 不同厂家 不同批号的琼脂糖 其杂质含量不同不同厂家 不同批号的琼脂糖 其杂质含量不同 影响影响 DNADNA 的迁移及的迁移及 其荧光背景的强度其荧光背景的强度 应有选择的使用应有选择的使用 2 2 凝胶的制备凝胶的制备 凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致 溶化的凝胶应该溶化的凝胶应该 及时倒入板中及时倒入板中 避免倒入之前凝固结块避免倒入之前凝固结块 倒入板中的凝胶应该避免出现气泡倒入板中的凝胶应该避免出现气泡 以免以免 影响电泳结果影响电泳结果 3 3 电泳缓冲液电泳缓冲液 为保持电泳所需的离子强度和为保持电泳所需的离子强度和 PH PH 应经常更新电泳缓冲液应经常更新电泳缓冲液 4 4 样品加入量样品加入量 一般情况下一般情况下 0 5CM 0 5CM 宽的梳子可加宽的梳子可加 0 50 5 微克的微克的 DNADNA 量量 加样量的多加样量的多 少依据加样孔的大小及少依据加样孔的大小及 DNADNA 中片断的数量和大小而定中片断的数量和大小而定 当加样孔大时当加样孔大时 样品上样样品上样 量应相应加大量应相应加大 否则会造成条带浅甚至辨认不清楚否则会造成条带浅甚至辨认不清楚 反之反之 则应该适当减少加样量则应该适当减少加样量 但但 是上样量过多会造成加样孔超载是上样量过多会造成加样孔超载 从而导致拖尾或扩散从而导致拖尾或扩散 对于较大的对于较大的 DNADNA 此现象此现象 更明显更明显 5 DNA5 DNA 样品中盐浓度会影响样品中盐浓度会影响 DNADNA 的迁移率的迁移率 平行对照样品中应该使用同样的缓冲平行对照样品中应该使用同样的缓冲 条件以消除这种影响条件以消除这种影响 6 DNA6 DNA 迁移率取决于琼脂糖的浓度迁移率取决于琼脂糖的浓度 迁移分子的形状及其大小迁移分子的形状及其大小 采用不同浓度的采用不同浓度的 凝胶有可能分辨范围广泛的凝胶有可能分辨范围广泛的 DNADNA 分子分子 制备琼脂糖凝胶可根据制备琼脂糖凝胶可根据 DNADNA 分子的范围来分子的范围来 决定凝胶的浓度决定凝胶的浓度 小片断小片断 DNADNA 的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 以提高分辨率以提高分辨率 什么是琼脂糖电泳的 其基本知识及操作方法是什么 不同形态的什么是琼脂糖电泳的 其基本知识及操作方法是什么 不同形态的 DNADNA 在琼脂在琼脂 糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变 糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变 什么是琼脂糖电泳的 其基本知识及操作方法是什么 不同形态的 DNA 在琼 脂糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变 以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳 二 琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法 1 制备琼脂糖凝胶时注意避免产生气泡 凝胶电泳分为垂直型和水平型 一般垂直型分离效果好于水平型 但水平 型可制备低浓度琼脂糖 制胶和加样比较方便 且电泳槽制作简单 价格低廉 用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶 水浴或微波炉中加热使琼脂糖完全 融化 将溶液冷至 55 用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板封边 放 置样品梳 梳齿下端离玻璃板 0 5 1 0mm 接着将融化的琼脂糖凝胶溶液 不间断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中 厚度依样品浓度而定 须注意避 免气泡混入 室温下自然凝固 待完全凝固后小心取出加样器 在电泳槽中 加入适量电泳缓冲液 使胶板浸没在电泳缓冲液下约 1mm 处 2 样品制备与加样 所加样品应有适当浓度与较小体积 用微量注射器缓慢加入样品 点样时 7 电源必须处于关闭状态 为了指示电泳的距离 避免样品在电泳槽缓冲液中飘 浮 常在制备好的样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂 溴酚蓝 二甲苯青 等 的上样缓冲液 另外 样品中含盐量不能太高 否则电泳中会出现区带消 失 前沿不齐等现象 样品中 DNA 含量以每条区带的 DNA 不少于 0 1 g 为宜 DNA 浓度过高会使电泳区带变宽 泳动距离异常 样品的用量由加样孔的体积决定 通常为 10 50 g 3 电泳 电泳温度视需要而定 对于大分子的分离 宜低温 电压应低 一般不超 过 5V cm 普通电泳可在室温进行 电泳的电压为 5 15V cm 4 染色 以 DNA 电泳为例 常用荧光染料溴化乙锭 EB 进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条 带 EB 能插入 DNA 分子中碱基对之间 使 EB 与 DNA 结合 超螺旋 DNA 与 EB 结合能力小于双链闭环 而双链闭环的 DNA 与 EB 结合能力小于线状双链 DNA 将以染色的凝胶浸泡在 1mmol lMgSO 4 溶液中 1 小时 可以降低未 结合的 EB 所引起的背景荧光 以提高检测的灵敏度 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构 型 同时与凝胶的浓度也有密切关系 1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 1 DNA 分子的大小 在凝胶中 DNA 片段迁移距离 迁移率 与碱基对的对数 成反比 因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比 较 便可测出未知片段的大小 但是当 DNA 分子大小超过 20kb 时 普通琼脂糖 凝胶就很难将它们分开 此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小 因此 就用 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 时 分子大小不宜超过此值 2 琼脂脂糖的浓度 如下表所示 不同大小的 DNA 需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离 表 琼脂糖浓度与 DNA 分离范围 琼脂糖浓度 0 3 0 6 0 7 0 9 1 2 1 5 2 0 线状 DNA 大小 kb 60 5 20 1 10 0 8 7 0 5 6 0 4 4 0 2 3 0 1 2 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型 DNA 的移动速度次序为 供价闭环 DNA covalently closed circular cccDNA 直线 DNA 开环的双链环状 DNA 当琼脂糖浓度太高时 环 状 DNA 一般为球形 不能进入胶中 相对迁移率为 0 Rm 0 而同等大小的 直线双链 DNA 刚性棒状 则可以长轴方向前进 Rm 0 由此可见 这三种 构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度 但同时 也受到电流强度 缓冲液离 子强度等的影响 生化及分子生物学试剂 DNA Hind Marker 单切 Marker 8 DNA Hind Marker 概述概述 DNA Hind Marker 是由 DNA 经 Hind 完全酶切并经灭活处理制成 浓度为 0 5 g L 已 含有 1xLoading Buffer 可以直接电泳 由 8 条片断组成 125bp 564bp 2027bp 2322bp 4361bp 6557bp 9416bp 和 23130bp 上样 量 0 5 1 g 储存 储存 20 保存一年以上 4 保存 2 3 个 1 Loading Buffer 说明 说明 1 loading Buffer 中含有溴酚兰 Bromophenol Blue 二甲苯 腈蓝 FF Xylene Cyanol FF 两种色素 用以判断 DNA 片断的电泳情况 溴酚蓝在 琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯腈蓝 FF 的 2 2 倍 这一特性与琼脂糖浓度无 关 在 0 5XTBE 琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长 300bp 的线状双链 Glycerol 5 溴酚兰 0 02 二甲苯腈蓝 0 02 9 DNA 相同 而二甲苯腈蓝 FF 约与长 4000bp 的 DNA 相同 上述关系在浓度范 围 0 5 1 4 的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响 注意事项注意事项 1 电泳时电压不应超过 20V cm 电压过高 会导致电泳缓冲液发热从而影 响 DNA 电泳效果 另外 DNA 分子泳动过快 小片段 DNA 分子可能会跑出凝 胶 而导致 DNA 片段丢失 2 对于 DNA cos 位点 该位点退火之后 DNA Hind Marker 的 4361bp 片段以及 DNA Hind EcoR Marker 的 3530bp 片段可能全部或 部分消失 为避免由于片段退火而产生 DNA 代带型的变化 应在点样前放在 65 水浴中加热 10min 然后在冰浴中冷却 5min 3 一般情况下 0 5cm 宽的梳子加样量为 0 5 g 的 DNA 量 即本产品点样 量 5 l 左右 当加样孔大时 样品上样量应相应加大 否则会造成条带浅甚至辨 认不清楚 反之则应当减少加样量 但是上样过多会造成片段脱尾或弥散 特 别是对于较大 DNA 片段尤为明显 4 DNA Marker 中的小片段可能会在长时间电泳之后条带变得很弱 应选择 合适电泳时间 或者加大 EB 浓度 5 在 DNA Marker 的储存或使用过程中应避免反复冻融 长期冷冻保存过程中 可能会形成 DNA 浓度梯度 使用时应在解冻后进行振荡混合并进行短暂离心 琼脂糖凝胶电泳实验技巧琼脂糖凝胶电泳实验技巧 作者 刘水平 罗志勇 来源 实用预防医学 时间 2008 5 19 10 摘要 琼脂糖凝胶电泳是核酸分析常用的实验技术 虽然很多参考书上均有该方法的介绍 El 但实际操作中的一些技巧是无法从书本上获得的 本文介绍 r 琼脂糖凝胶电泳的实验 技巧 这些经验源自多年的研究生教学实践 对初涉分子生物学实验者有一定的指导意义 关键词 琼脂糖凝胶 电泳 技巧 实用预防医学 2006 年 8 月 第 13 卷第 4 期 Practical Preventive Medicine Aug 2006 Vol 13 No 4 核酸分子是两性解离分子 在高于其等电点的电泳缓冲液中 其碱基不解离 而磷酸基团 全部解离 核酸分子因而带负电荷 电泳时向正极迁移 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提 取而来并经糖基化修饰 为一种聚合链线性分子 使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质 发 挥分子筛功能 使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异 从而达到分离的 目的 琼脂糖凝胶电泳操作简单 快速 通过调整其使用浓度 使得分辨率达到大多数实 验的要求 因此成为分离 鉴定 纯化核酸分子的常用方法 但操作过程中仍有不少要注 意的问题 1 凝胶制作凝胶制作 1 1 凝胶浓度 配制凝胶的浓度据实验需要而变 一般在 0 8 2 0 之间 如果 一次配制凝胶 100 ml 没用完的凝胶可以再次融化 但随着融化次数的增加 水分丢失也 越多 凝胶浓度则会越来越高 导致实验结果不稳定 补水办法 一是在容器上标记煮胶 前的刻度 煮胶后补充相应的水分至原刻度 二是在煮胶前称重 煮胶后补充水至原重量 粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值 以保证凝胶浓度基本 维持在原浓度 核酸染色剂溴化乙锭 ethidium bromide 可加在融化的琼脂糖中 终浓度为 0 5 t g ml 也可在电泳结束后染色 1 2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板 梳齿宽厚 形成的点样 孑 L 容积较大 用于 DNA 片段回收实验等 相反 梳齿窄而薄 形成的点样孑 L 容积就 较小 用于 PCR 产物 酶切产物鉴定等 梳板的选择主要是看上样量的多少而定 一般 来说 上样量小时尽量选择薄的梳板制胶 此时电泳条带致密清晰 便于结果分析 另外 每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要 1 mm 否则 拔梳板时易损坏凝胶孑 L 底 11 层 导致点样后样品渗漏 当然 点样孑 L 的破坏还与拔梳板的时间和方法有关 一般凝 胶需冷却 30 min 以上方可拔梳板 应急的情况下可以将成型的凝胶块放 4 冰箱中冷却 15 min 左右 拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中 然后垂直向上慢 慢用力 因为有液体的润滑作用 梳板易拔出且不易损坏点样孑 L 2 点样 点样需加上样缓冲液 因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度 使样品沉入孑 L 底 指示样品的迁移过程 上样缓冲液中一般加了两种指示剂 溴酚兰和二甲苯青 值得注意的 是指示剂并非染色剂 DNA 染色剂是溴化乙锭 而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色 荧光 上样缓冲液储存液一般为 6 10 表示其浓度为工作浓度的六倍 使用时上样缓 冲液应稀释到一倍浓度 点样方法是将移液器基本垂直点样孑 L 用另一只手帮助固定移 液器下端 移液器枪头 Tip 尖端进入点样孑 L 即可将样品注入孑 L 内 千万不可将 Tip 尖 插至孑 L 底 并点上适合的 DNA 分子量标准 所谓适合是指样品 DNA 分子量大小应基本 在 DNA 分子量标准范围之内 3 电泳 将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连 负极与负极相连 核酸带负电荷 从负极向正极移 动 电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同 电泳缓冲液刚好没过凝胶 1 mm 为 好 电泳缓冲液太多则电流加大 凝