大肠杆菌的保存和培养_第1页
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大肠杆菌的保存和培养 1 菌种的保存 菌种的保存通常采用甘油低温保存法 1 1 基本原理 在 70 或液氮中冻存 细菌内的酶活性均己停止 即代谢处于完全停止状 态 故可以长期保存 在 0 70 温度范围内 水晶呈针状 极易招致细菌的严重损伤 用电镜观察 可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔 因此 为了避免 0 70 冰晶的形 成和细菌膜两侧离子平衡的破坏 需要加保护剂 甘油可降低冰点 在缓慢的冻结条件下 能使细菌内水分在冻结前透出细菌外 贮存在 70 以下低温中能减少冰晶形成 甘油对细 菌无毒性 分子量小 溶解度大 易穿透细菌 1 2 使用浓度范围为 15 50 一般常用 30 在保存瓶中按 1 1 加入 60 的甘油和菌液 混匀后液氮速冻 然后放入 70 度超低温冰箱贮存 2 菌种的复苏 复苏菌种时 用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上 37 培养 8 12 小时即可 甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或 0 冰浴中 用完尽快放回 接种时挑取表面已融 化部分即可 不可全溶 因反复冻融会导致细胞壁破裂 切记 接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化 3 大肠杆菌培养 3 1 培养基配制 培养基从形态上分为液体与固体培养基 根据有无抗生素和其他选择性药 物分为普通与选择培养基 常用 LB 培养基 3 1 1 LB Luria Bertain 液体培养基配制 蛋白胨 1 0 酵母提取物 0 5 氯化钠 1 0 称重后搅拌使之完全溶解 用 5M NaOH 调 pH 至 7 0 高压灭菌 20min 3 1 2 含琼脂的固体培养基配制 1 普通培养基 固体培养基是在液体培养基中加 1 5 琼脂制成 先配液体培养基 然后 加入 1 5 琼脂 高压灭菌 20min 取出后再无菌状态下铺平板 2 选择性培养基 将消毒好的固体培养基置室温下冷却 50 时加抗生素 摇匀后倒入灭 菌皿中厚度 2 3mm 室温固化 抗生素用三蒸水溶解后 用无菌滤头过滤到无菌瓶中 氨 苄青霉素终浓度 50 l ml 然后 4 保存备用 3 2 液体细菌培养 3 2 1 小量培养 1 取灭菌 16 或 18mm 口径培养管 加 3 5mlLB 培养基 再加 50mg ml 氨苄青霉素 3 5ul 宿主菌不加抗生素 2 无菌牙签挑取单菌落 送入培养液中 或取菌液 5 10ul 转入培养液中 封好管口 3 37 摇床培养 100 200r min 至生长饱和 约 6 12 小时 3 2 2 大量培养 取 500ml 培养瓶内装培养基 100 200ml 及相应抗生素 以 0 5 1 浓度 接种菌液 37 度摇床培养 100 200r min 至 OD 值 0 6 0 8 3
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