实验五-人类染色体标本制备

实验五实验五 人类染色体标本制备人类染色体标本制备 目的要求目的要求 1 熟悉人外周血淋巴细胞培养的原理 2 初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备方法 3 了解正常人非显带染色体核型特征及核型分析方法 实验原理实验原理 人类间期细胞核中的遗传物质染色质 在细胞进入分裂期时 经逐级螺旋形成染色体 在分裂期的中期 染色体达到最大程度的凝集 表现为短而粗的典型结构 人外周血的有 形成分中 只有白细胞有核 而白细胞中只有淋巴细胞 主要是小淋巴细胞 具有潜在的细 胞分裂能力 培养液中加入有丝分裂刺激剂植物血凝素 PHA 可使处于G0期 具有潜在分裂能力的淋 巴细胞转化为具有分裂能力的淋巴母细胞 并进入旺盛的有丝分裂周期 加入纺锤体抑制 剂秋水仙素可使处于分裂过程的淋巴细胞停滞在分裂中期 在收获细胞时 用低渗剂0 075 mol L KCl对细胞进行低渗处理 可使胞膜胀破 染色体均匀分散 经离心 固定 制片等 过程 最终可获得便于观察分析的染色体标本 制备的染色体标本片 不经特殊处理 直接染色 在显微镜下观察识别 并进行核型 分析的过程称为染色体非显带核型分析 实验用品实验用品 一 材料 人外周静脉血 二 器材 吸管 刻度离心管 量筒 5ml注射器 6号针头 台式离心机 试管架 冷藏载玻片 一端磨砂 铅笔 酒精灯 超净工作台 恒温水浴箱 载玻片 止血带 酒精棉球 显微镜 废液缸 三 试剂 1 RPMI1640培养液 1 RPMI1640 RPMI1640固体培养基10 4 g 溶于1000 ml双蒸水中 抽滤除菌 2 RPMI1640培养液 每100 ml RPMI1640培养液中含RPMI 1640 80 ml 灭活的小牛 血清20 ml PHA 50 mg 青霉素 终浓度100 U ml 链霉素10000 g 终浓度100 g ml 15磅 20min高压灭菌的NaHCO3调pH至7 2 7 4 分装20小瓶 每瓶5 ml 3 配制方法 配制过程所需的玻璃器具先用浅水洗刷干净 烘干 放入清洁液中浸泡 2 d 取出后用自 来水冲洗 15 次 蒸馏水冲洗 3 次 双蒸水冲洗 1 次 烤干后包装 15 磅 20 min 高压灭菌 新瓶塞等橡胶类制品用水洗刷后 用 0 5mol L NaOH 煮沸 20min 自来水冲洗 用 0 5mol L HCl 煮沸 20 min 自来水冲洗 蒸馏水冲洗 在双蒸水中浸泡 24h 浸泡后取出晾干 包装后高压灭菌 使用过的橡胶制品用肥皂液洗后 再用自来水 蒸馏水 双蒸水冲洗 晾干 包装后高压灭菌 无菌室用紫外灯消毒 2 h 进入无菌室前用肥皂彻底洗手 双手在新洁而灭溶液中浸泡 20 min 然后穿隔离衣 戴口罩 帽子 进入无菌室操作时 再用 75 酒精擦手 在无菌室内 将 RPMI l640 粉剂 10 4 g 溶于 1000 ml 双蒸水中 RPMI1640 粉剂较难溶 可用酒精灯微火稍加热 或通入 CO2使 pH 降至 6 0 左右可溶解 液体呈透明状说明已完全溶 解 倒入细菌滤器中过滤除菌 在无菌室的超净工作台内 取适量已抽滤的 RPMI1640 加入成比例的灭活小牛血清 PHA 青霉素和链霉素 混匀 用经过 15 磅 20 min 高压灭菌的 5 NaHCO3调至 pH7 2 分装成每瓶 5 ml 冰冻保存 已除菌过滤 未分装的 RPMI1640 也需冷冻保存 2 无菌肝素 500 U ml 肝素注射液1支2 ml 含12500 U 加23 ml无菌生理盐 水混匀 或肝素粉剂 用时配成0 2 肝素液 经8磅15 min高压灭菌 置4 冰箱保存备 用 3 其他试剂 0 01 秋水仙素 0 075 mol L KCl低渗液 Carnoy固定液 10 Giemsa 染液 实验操作实验操作 一 染色体标本制备 1 取材培养 1 采血 用无菌注射器吸取约0 2 ml肝素液 来回抽动针筒 使肝素湿润针筒 戴 上针头套 彻底消毒采血处皮肤 抽取静脉血约2 ml 戴上针头套 转动针筒 使肝素与 血液混匀 防止血液凝固 采血过程中严格执行无菌操作 在超净工作台内 去掉针头套 用无菌棉球擦除针头上的血迹 用酒精棉球消毒盛有5 ml培养液的培养瓶瓶塞 并将瓶塞在酒精灯火焰上过一下 在酒精灯火焰旁 将采血的注 射器针头经培养瓶皮塞插入培养瓶中 每瓶接种血液约0 3 ml 轻轻摇匀 2 培养 培养瓶置37 恒温箱中培养 当培养至68 h 取出培养瓶 在超净工作台 内 用注射器 5号针头 向培养瓶中加入0 01 秋水仙素1滴 轻轻摇匀 放回37 恒温箱继 续培养至72 h 2 气干法制片 1 收集细胞 将培养瓶中的培养物用吸管移入刻度离心管内 离心8 10 min 1000 r min 弃上清液 为防沉淀物中细胞丢失 可适当留点上清液 2 低渗 向离心管中加6m1预温37 的0 075 mol L KCl低渗液 用吸管向离心管底 部充气 轻轻将细胞沉淀冲散打匀 离心管放入37 水浴箱中低渗处理15 min 3 预固定 低渗处理后 加Carnoy固定液约0 5 1 ml 用吸管轻轻冲打混匀 预固 定 然后离心8 10 min 1000 r min 弃上清液 预固定可防止细胞在固定时集聚成块 4 固定 在沉淀物中加Carnoy固定液5 m1 用吸管将沉淀物轻轻冲打均匀 室温下 静置固定20 min 离心8 10 min 1000r min 弃上清液 固定有利于染色体在载玻片上 展开 保持染色体结构完整 如固定不充分 则染