微生物遗传与育种复习资料

微生物遗传与育种复习资料微生物遗传与育种复习资料 1 第二章第二章 基因突变及其机制基因突变及其机制 1 1 染色体畸变和基因突变的不同 染色体畸变和基因突变的不同 答 染色体畸变指染色体结构的改变 由于染色体断裂 重新排列而产生的染色体的缺 失 重复 倒位 易位 往往涉及多个基因 基因突变是指一个基因内部的遗传结构或 DNA 序列的改变 由于一对或少数几个核 苷酸的缺失 插入或置换而产生的碱基置换 移码突变 通常只涉及一个基因 染色体畸变是发生在染色体水平的突变 基因突变是发生在基因水平的突变 染色体畸变涉及到 DNA 分子上较大的变化 有可能使细胞致死 基因突变一般只涉及 DNA 上一对或几个核苷酸的缺失 1 21 2 化学诱变剂的种类 适用范围及如何终止反应 化学诱变剂的种类 适用范围及如何终止反应 答 碱基类似物碱基类似物 5 溴尿嘧啶 5 BU 诱发 AT GC GC AT 更容易 2 氨基嘌呤 2 AP 诱发 AT GC AT GC 更容易 一般要经过两轮复制才能形成稳定的可遗传突 变 只对生长的微生物起作用 对静止的细胞如细胞悬液 孢子悬液 芽孢悬液不起作用 可通过从含有碱基类似物的培养基中挑取菌落移植到正常培养基中培养终止反应 碱基修饰剂碱基修饰剂 脱氨剂如 HNO2诱发 AT GC 还可以氨基的交联作用 羟化剂 如羟 胺 诱发 GC AT 可以通过改变 pH 终止反应 移码突变剂移码突变剂 吖啶类染料 溴化乙锭 ICR 类化合物 移码诱变剂的嵌入并不导 致突变 必须通过 DNA 的复制才能够形成突变 因此只能用于生长态细胞 可通过从含移 码突变剂的培养基中挑取菌落移植到正常培养基中培养终止反应 1 31 3 紫外线的诱变机制及操作方法 紫外线的诱变机制及操作方法 答 诱变机制 诱变机制 DNA 分子尤其是嘧啶强烈吸收紫外线 造成相邻的胸腺嘧啶形成稳定的二 聚体 T T T 与 T 之间形成化学键连接 对热和酸都稳定 DNA 分子在复制时 两 条链之间的 T T 会阻碍双链的分开 导致复制无法正常进行 同一条链上的 T T 会阻止 A 的正常掺入 导致复制停止或错误进行 最终形成突变 操作方法 操作方法 取已培养好的新鲜斜面菌种 用无菌生理盐水洗下 接于盛有玻璃珠的 100 毫升三角瓶中 充分摇动 10 分钟 使菌体均匀分散 用滤纸过滤 即为菌悬液 取上述菌悬浮液计数 调整菌悬浮液密度为 108 个 毫升 吸取 1 毫升菌悬浮液于 9 毫升无菌水中 稀释后再计数一次 取 3ml 至平皿中 照射处理前 先开紫外线灯 20 分钟 使灯的功率稳定 如灯的功率为 15 瓦 则照射 距离为 15 30 厘米 灯的功率为 30 瓦 则照射距离为 30 50 厘米 将待处理的菌悬液放于培养皿中 置于电磁搅拌器上 放在紫外线灯正中下方 先将 整个平皿照射 1 分钟后 打开皿盖 此时开始记时并启动电磁搅拌器 准确计算照射时间 1 41 4 DNADNA 的修复 的修复 答 复制修饰系统 I DNA 聚合酶的校读功能 II N 糖基酶修复系统 III 错配修 复系统 损伤修复 I 光复活 II 切除修复 III 重组修复 IV SOS 修复系统 唯一一 个导致突变的修复 2 2 第三章第三章 工业微生物生产菌的分离筛选工业微生物生产菌的分离筛选 2 12 1 从土壤中取样的方法 从土壤中取样的方法 答 将表层 5cm 左右的浮土除去 取 5 25 cm 处的土样 10 25g 装入事先准备 的塑料袋内扎好 给塑料袋编号并记录地点 土壤质地 植被名称 时间及其他环境 条件 将土样去除石块 草根 在无菌研钵中研磨压碎 称取 5g 加入含 45ml 无 菌水的三角瓶 振荡 10min 静置 30s 的 10 1 土壤悬液 取 4 支装有 9ml 无菌水的 试管 依次稀释成 10 2 10 3 10 4 10 5 的菌悬液 取 10 5 10 4 10 3 菌悬液各 0 5ml 涂布于培养基表面 每个浓度梯度涂布 3 块平板 2 22 2 如何选择采样地点及时间 如何选择采样地点及时间 答 一 根据微生物的营养类型 如 森林土 富含纤维素 能分离纤维素酶的生 产菌 肉类加工厂和饭店排水沟附近的土壤 能分离到蛋白酶和脂肪酶的 生产菌 面粉厂 糕点厂 淀粉加工厂及酒厂附近的土壤 能分离到淀粉酶 糖化酶的生产菌 二 根据微生物的生理特征 如 筛选高温菌 到温泉 火山口等地采集 筛选低温菌 到南北极 冰窖 深海等初采 耐压菌 到深海采集 耐高渗透压菌 到甜果 花蜜 蜜饯等处采集 秋季土壤中的微生物种类和数量最多 为最佳采样时间 2 32 3 厌氧微生物的分离 厌氧微生物的分离 答 1 1 加还原剂 加还原剂 分离培养基内加入还原剂 如半胱氨酸 D 型维生素 硫化钠 等 快速划线分 离 立刻置于事先抽真空的容器 或事先充满 CO2 N2 的密闭容器中适温培养 2 2 焦性没食子酸法 焦性没食子酸法 先将焦性没食子酸放在容器内 将含有厌氧菌的培养皿架空放入容器内 加入 NaOH 溶液 立即盖上盖子 并用凡士林密封 适温培养 3 3 平皿厌气培养法 平皿厌气培养法 取一套无菌培养皿 在皿盖上倒入分离培养基 凝固后 在皿底一侧放焦性没食子酸 固体 另一侧放 10 NaOH 二者不混 快速将样品液在分离培养基上划线 盖上 皿盖并密封 摇动平皿 是焦性没食子酸和 NaOH 混合发生化学反应 出去皿中 的氧气 适温培养 2 42 4 菌种分类鉴定主要步骤菌种分类鉴定主要步骤 答 对要鉴定的菌株进行纯化 测定一系列必要指标 包括 细胞形态和习性 形态特征 运动 酶反应 营养要 求及生长条件等 细胞组分水平 细胞成分 氨基酸库 脂类 醌类 光合色素等分析 蛋白质水平 氨基酸序列分析 凝胶电泳分析和血清学反应等 基因或 DNA 水平 核 酸分子杂交 G C mol 转化和转导 16SRNA 寡核苷酸序列分析 DNA 或 RNA 核苷酸 序列分析等 查找权威鉴定手册 1 原核生物分类系统 伯杰氏系统细菌学手册 2 真菌界分 类系统很多 较多人接受的是 Ainsworth 的纲要 3 微生物数码分类表 统计分类法 3 3 第四章第四章 工业微生物菌种复壮与保藏工业微生物菌种复壮与保藏 3 13 1 菌种退化的原因 菌种退化的原因 答 基因突变 导致菌种退化的主要原因 质粒丢失 连续传代 加速菌种退化的直接原因 培养和保藏条件的影响 3 23 2 菌种退化的防止 菌种退化的防止 答 尽量减少传代 菌种经常纯化 创造良好的培养条件 用单核细胞移植传代 采用有效的菌种保藏方法 3 33 3 菌种复壮的主要方法菌种复壮的主要方法 答 纯种分离纯种分离 纯纯种种分分离离法法纯纯种种分分离离法法 菌菌落落纯纯菌菌落落纯纯 细细胞胞纯纯细细胞胞纯纯 平平板板表表面面涂涂布布法法平平板板表表面面涂涂布布法法 平平板板划划线线分分离离法法平平板板划划线线分分离离法法 琼琼脂脂培培养养基基倾倾注注法法琼琼脂脂培培养养基基倾倾注注法法 用用用用 分分离离小小室室分分离离小小室室 进进行行单单细细胞胞分分离离进进行行单单细细胞胞分分离离 用用显显微微操操纵纵器器进进行行单单细细胞胞分分离离用用显显微微操操纵纵器器进进行行单单细细胞胞分分离离 用用菌菌丝丝尖尖端端切切割割法法进进行行单单细细胞胞分分离离用用菌菌丝丝尖尖端端切切割割法法进进行行单单细细胞胞分分离离 淘汰法淘汰法 淘汰已衰退的个体 如采用 10 30 处理产放线菌素的 Streptomyces microflauus 的 分生孢子 5 7 天 死亡率 80 存活下来的是未退化的健壮个体 达到复壮的目的 宿主体内复壮法宿主体内复壮法 对于寄生性微生物的退化菌株 可通过接种相应的昆虫等动 植物体内的措施来提高他们 的活性 3 43 4 菌种保藏的原理 步骤及条件 菌种保藏的原理 步骤及条件 答 原理 原理 根据微生物的菌种生理 生化特性 在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞 的代谢强度 使细胞基本处于休眠状态 生长繁殖受到抑制但不至于死亡 以减低菌种的 变异率 低温 干燥 缺氧 缺乏营养 能抑制微生物的代谢作用 步骤 步骤 1 挑选特征典型的纯菌菌落 2 确定保藏的合适菌体形态 最好是休眠体如分生孢子 芽孢等 3 选择最适宜的保藏方法 4 定期对所保藏的菌种进行检查 观察其是否出现变化 如果出现变化 必须改变保藏方 法 5 保藏期满应及时进行移种 条件 条件 A 干燥 B 低温 C 缺氧 D 避光 E 缺乏营养 F 添加保护剂 酸度调节剂 3 53 5 菌种保藏的方法 菌种保藏的方法 答 1 斜面保藏法 一般置于 4 保藏 1 3 个月移接一次 继续保藏 2 液体石蜡油保藏法 一般置于 4 保藏 3 5 年传代一次 3 干燥保藏法 针对会产生孢子的放线菌 霉菌以及能产生芽孢的细菌 孢子或芽孢 在干燥环境中抵抗力强 处于休眠状态 不易死亡 可保藏 2 5 年 有的甚至长达 20 年 4 冷冻干燥保藏法 可保藏 5 10 年 5 真空干燥法 6 液氮超低温保藏法 保藏时间最长 7 液相保藏法 8 工程菌的保藏 注 大家选择一种保藏方法并记住其步骤 注 大家选择一种保藏方法并记住其步骤 4 4 第五章第五章 基因突变的应用基因突变的应用 4 14 1 诱变育种的一般过程 诱变育种的一般过程 答 出发菌株的选择出发菌株的选择 原种特征考察原种特征考察 摇瓶初筛摇瓶初筛 摇瓶培养摇瓶培养 活化和同步培养活化和同步培养 对照组对照组 挑选高产菌株挑选高产菌株 菌种保藏菌种保藏 制备单孢子或单细胞悬液制备单孢子或单细胞悬液 活菌计数活菌计数 传种斜面活化传种斜面活化 诱变培养诱变培养 活菌计数活菌计数 计算致死率计算致死率 摇瓶复筛摇瓶复筛 可反复进行多次可反复进行多次 后培养后培养 对照组对照组 挑选高产菌株挑选高产菌株 稀释涂布平板稀释涂布平板 进行稳定性试验和菌种特性考察进行稳定性试验和菌种特性考察 优化培养条件优化培养条件 平板预筛平板预筛 挑取单菌落接种斜面挑取单菌落接种斜面 观察并记录其形态特点观察并记录其形态特点 发酵罐中试发酵罐中试 终筛终筛 优化培养条件优化培养条件 大规模生产放大试验大规模生产放大试验 进一步诱变进一步诱变 注 具体问题结合上述过程回答 注 具体问题结合上述过程回答 4 24 2 出发菌的选择要求 出发菌的选择要求 答 1 尽量选择既往诱变史少的高产菌株 2 挑选纯系菌株 3 选择对诱变剂敏感的菌株 4 选择单倍体的单核细胞 5 采用多出发菌株 在不了解出发菌株对诱变菌敏感性的情况下 可考虑 6 更换出发菌株 当某一选育谱系经过长期诱变处理效果不理想时 可考虑 4 34 3 诱变剂的选择要求 诱变剂的选择要求 答 A 尽量选择毒性小 易于防护 安全性强的诱变剂 B 尽量选择操作简便易行 便宜易得到诱变剂 C 尽量选择不易发生回复突变的诱变剂 D 在反复使用同一诱变剂进行长期诱变处理后 应换其他诱变剂进行处理 4 34 3 采用紫外线与光复合复合处理的原因 采用紫外线与光复合复合处理的原因 答 通过光复活酶的修复作用 导致嘧啶二聚体解体恢复原来的 DNA 结构 甚至一些接近 死亡的菌体也会恢复基本的生活能力 但它们中的某些代谢失调现象不一定能得到调 整 即群体中那些突变体将保留下来 提高了突变率 4 44 4 琼脂块大通量筛选突变菌株的一般过程 琼脂块大通量筛选突变菌株的一般过程 答 将诱变后的菌悬液涂布培养 每皿控制 30 50 个菌落 适温培养到刚刚长出针尖样 菌落 还未产生抗生素或酶 用内径为 6mm 的打孔器 将菌落连同下面的琼脂培养基一起取出 转移到无菌的空白平 皿内 适温培养到所有菌落的产物达到高峰期 将琼脂块移到检定板上 温育 测定并比较形成 的抑菌圈或水解圈的大小 挑出高产菌株 可淘汰 95 的低产菌株 4 54 5 检出营养缺陷突变菌株的方法 检出营养缺陷突变菌株的方法 答 逐个检出法 逐个检出法 将处理液在 CM 平板上培养分离 将菌落用无菌牙签一一对应地点种在 MM CM 平 板上相应的位置 培养一段时间后 逐个对照 在 CM 上生长而在 MM 上不长的菌株 初步认为是营养缺陷型菌株 夹层检出法 夹层检出法 先在培养皿内倒一层 MM 作底层 冷凝后 再倒一层含菌的 MM 冷凝后 在倒一 层 MM 培养一段时间 在长出菌落的部位在皿底做记号 在上面再加一层 CM 培养 一段时间 找出新长出的菌落 即可能是营养缺陷型 限量补充检出法 限量补充检出法 将经过处理的菌液接种在含有微量蛋白胨 0 001 的 MM 上培养 野生型迅速 长成大菌落 而营养缺陷型只能缓慢生长 形成小菌落 影印培养法 影印培养法 与逐个检出法类似 但操作简单得多 用灭菌的绒布制成 印章 在一块涂布了菌液 并培养出菌落的 CM 平板上印一下 依次转接到一块 MM 和一块 CM 平板上 观察菌落的 生长情况 可以初步判断出营养缺陷型菌株 4 64 6 反馈抑制和反馈阻遏的不同点 反馈抑制和反馈阻遏的不同点 答 反馈抑制是终产物对代谢过程中酶的抑制是在酶的水平 反馈阻遏是合成代谢的相 关酶的基因组成操纵子 其表达受到终产物的阻遏 是在基因的表达水平 反馈抑制的特点是快 有效 经济 直接 反馈阻遏的特点是反应较慢 但很经济 有效 4 74 7 什么是结构类似物 什么是结构类似物 答 结构类似物 又称代谢拮抗物 是指那些在结构上和代谢终产物相似 可以起到代谢物所具有的调节作用 即与变构酶的调节中心结合而抑制酶的活性 或者与阻遏蛋白结合激活阻遏蛋白 不具备其生理活性 由于不能掺入细胞 其反馈调节作用不会被解除 4 84 8 温敏突变株的筛选步骤 温敏突变株的筛选步骤 答 出发菌株出发菌株 诱变剂诱变剂 后培养 富集培养后培养 富集培养 在非许可温在非许可温 对丝状菌体或培养 对丝状菌体或培养 在培养基中添在培养基中添 度下培养 度下培养 孢子可将其在孢子可将其在 加加 H3 H3 氨基酸 在氨基酸 在 添加抗生添加抗生 非许可温度下非许可温度下 非许可温度下培非许可温度下培 素 杀死野素 杀死野 野生型成长成菌野生型成长成菌 养 野生型的在生养 野生型的在生 生菌株生菌株 丝 通过过滤除去丝 通过过滤除去 长过程中掺入长过程中掺入 H3H3 从而被杀死 从而被杀死 涂涂布布分分离离涂涂布布分分离离