支原体(mycoplasma)是一类没有细胞壁的原核细胞型微生

1 第 17 章 支原体 支原体 mycoplasma 是一类没有细胞壁的原核细胞型微生物 细胞膜含固 醇 能通过 0 45 m 滤菌器 但呈二分裂繁殖 含 DNA 与 RNA 支原体是目前 所知能在无生命培养基中繁殖的最小微生物 过去曾称为类胸膜肺炎微生物 pleuropneumonia like organism PPLO 由于它们能形成有分枝的长丝 故称 之为支原体 第一节 概 述 支原体因其没有细胞壁故归属于柔膜体纲 Mollicute 的支原体目 Mycoplasmatales 下分 3 个科 支原体科 Mycoplasmataceae 无胆甾原 体科 Acholeplasma taceae 生长时不需要外源性胆固醇 螺原体科 Spiroplasmataceae 生长至一定阶段呈螺形 在支原体科中又分支原体 Mycoplasma 和脲原体 Ureaplama 2 个属 支原体属现知有 64 个种 而脲原 体属 仅 2 个种 其中对人致病的主要为肺炎支原体 M pneumoniae 人型支 原体 M hominis 生殖器支原体 M genitalium 穿透支原体 M penetraus 和 溶脲脲原体 U urealyticum 一 生物学性状 形态与结构形态与结构 支原体是原核细胞生物中最小的 大小一般在 0 2 0 3 m 很 少超过 1 0 m 最外层是细胞膜 由蛋白质与脂质组成的三层结构 内 外 二层主要是蛋白质 中间层为脂质 在脂质中固醇约占 36 凡能作用于固 醇的物质 如二性霉素 B 皂素 毛地黄苷等能引起支原体细胞膜的破坏而 死亡 有的支原体在细胞膜外还有一层由多聚糖构成的荚膜 有毒性 是支 原体的一种致病因素 支原体以二分裂繁殖为主 也见出芽 分枝或由球体延伸成长丝 然后分 节段成为许多球状或短杆状的颗粒 图 17 1 图 17 1 有的支原体有一种特殊的顶端结构 能使支原体粘附在宿主上皮细胞表面 这与支原体在粘膜上的定植和致病有关 有些支原体能运动 在支原体内有 许多微丝组织成网 和运动有关 在前进方向微丝成束 向前突出 也有认 为顶端结构在表面上呈交替粘附和释放 造成支原体在表面滑动 支原体无 细胞壁 具有可塑性 能通过 0 45 m 滤膜 2 支原体和其他原核生物一样 基因组是一个环状双链 DNA 分子量较小 只有大肠埃希菌的 1 5 故其合成和代谢很有限 支原体用普通染色不易着色 用 Giemsa 法染色着色很浅 革兰染色阴性 培养特性培养特性 支原体的营养要求比一般细菌高 除无胆甾原体外 培养基中必 须加入 10 20 人或动物血清 血清主要用于提供固醇和其他长链脂肪酸 不但是细胞膜合成需要 且具稳定细胞膜的作用 支原体一般在 pH7 8 8 0 间生长 低于 7 0 则死亡 但溶脲脲原体最适的 pH 为 6 0 6 5 因在培养时溶脲脲原体分解尿素产氨 可使培养基 pH 升高 当培养基指示剂变色即需移种 否则将迅速死亡 支原体一般为兼性厌氧 仅个别菌株专性厌氧 支原体生长缓慢 在含 1 4 琼脂的固体培养基上孵育 2 3d 有的需要 2 周 后出现菌落 典型的菌落呈荷包蛋样 核心较厚 向 下长入培养基 周边为一层薄薄的透明颗粒区 图 17 2 有的整个菌落呈 颗粒状 肺炎支原体的菌落较大 直径 100 150 m 溶脲脲原体的菌落最小 仅 10 40 m 故曾称 T 株 tiny strain 支原体的菌落小 宜在低倍镜下观 察 图 17 2 在液体培养基中支原体的生长量较少 且个体小 一般不易见到混浊 只 有小颗粒沉于管底 溶脲脲原体在生长量最大时每 ml 不超过 106 107个菌落 形成单位 CFU 故液体清亮 支原体在固体和液体培养基中生长达高峰 后 若继续培养 则很快死亡 在低温下可延长存活时间 支原体是污染细胞培养的一个重要因素 支原体在细胞培养中不一定都引 起细胞病变 但可影响这些细胞用于病毒培养 生化反应生化反应 支原体可根据是否能利用葡萄糖 水解精氨酸和尿素来进行鉴 别 表 17 1 人类主要支原体生物学性状 支原体 葡萄糖 精氨酸 尿素 吸附细胞 致病性 肺炎支原体 红细胞 肺炎 支气管炎 人型支原体 泌尿生殖道感染 3 生殖器支原体 泌尿生殖道感染 穿透支原体 红细胞 多见于艾滋病 CD4 T 细胞 巨噬细胞 溶脲脲原体 泌尿生殖道感染 抗原结构抗原结构 支原体细胞膜上的抗原结构由蛋白质和糖脂组成 各种支原体均 有其特有的抗原结构 交叉较少 在鉴定支原体时有重要意义 补体结合试 验取决于抗原的糖脂部分 ELISA 试验取决于抗原的蛋白质部分 支原体的 血清抗体可用作生长抑制试验 growth inhibition test GIT 和代谢抑制试验 metabolic inhibiton test MIT 特异性与敏感性均高 GIT 试验的操作步骤与 药敏试验的纸片法相似 将沾有特异性抗血清纸片贴于划有支原体的琼脂平 板表面 若两者相应则纸片周围生长的菌落受到抑制 MIT 试验是将支原体 接种在一个含有抗血清与酚红的葡萄糖培养基中 若抗体与支原体相应 则 支原体的生成 代谢受到抑制 酚红不变颜色 应用这二种方法还可将某些 支原体分成若干血清型 如溶脲脲原体可分为 16 型 抵抗力抵抗力 支原体因无细胞壁对理化因素的影响比细菌敏感 容易被消毒剂 灭活 但对醋酸铊 结晶紫的抵抗力大于细菌 在分离培养时 培养基中加 入一定量醋酸铊可除去杂菌生长 脲原体例外 对醋酸铊敏感 但因其培养基 在 pH6 0 左右 亦能抑制许多杂菌生长 抑制真菌可加 1 g ml 两性霉素 B 支原体对干扰细胞壁合成的抗生素耐药 但对干扰蛋白质合成的抗生素如强 力霉素 氯霉素 红霉素 螺旋霉素 链霉素等敏感 近年来国内应用强力 霉素较普遍 1999 年有报道 1 5 的溶脲脲原体与 1 4 人型支原体对强力霉素 已产生耐药 耐药株对环丙沙星和氧氟沙星仍敏感 二种支原体对交沙霉素 均高度敏感 由于它们大多携带耐四环素基因 tetM 故大多对四环素耐药 二 致病性与免疫性 致病性致病性 支原体广泛存在于人 动物体 大多不致病 对人致病的主要有 肺炎支原体 可引起原发性非典型肺炎 溶脲脲原体 人型支原体和生殖器 支原体在一定条件下也能引起泌尿生殖系统感染和不育症 肺炎支原体 生 殖器支原体及穿透支原体以其顶端结构能与宿主细胞上受体结合而粘附于细 胞上 除穿透支原体外 一般为表面感染 大多不侵入血液 其致病性可通 4 过不同机制引起细胞损伤 从细胞膜获得脂质和固醇作为养料 产生有毒 的代谢产物 如神经毒素 外毒素 或产生过氧化氢和超氧离子 溶脲脲原 体有尿素酶可水解尿素放出大量氨 对细胞有毒害 且可促使结石形成 溶 脲脲原体有粘附精子作用 影响精子动力 且与人精子膜有共同抗原 可因免 疫损伤而致不育 穿透支原体能粘附并侵入 CD4 T 淋巴细胞引起免疫损伤 免疫性免疫性 在小鼠体内腹腔巨噬细胞可以杀灭支原体 IgG1 和 IgG2 抗体有调 理作用可加强巨噬细胞对支原体的杀伤作用 粘膜产生的 SIgA 具有保护作用 肺炎支原体可作为超抗原 吸引炎症细胞浸润 同时释放细胞因子 开始为 TNF 和 IL 1 随后为 IL 6 这些因子可进一步清除病原体 细胞免疫缺陷 的小鼠对支原体易感 可引起弥散型感染 穿透支原体可粘附 入侵人类红 细胞 CD4 T 细胞与单核吞噬细胞 损伤红细胞及破坏细胞免疫 诱发严重 感染与加重艾滋病 三 与细菌 L 型的区别 细菌在一些影响细胞壁合成的抗生素 溶菌酶 抗体和补体的作用下可变 成细胞壁缺陷的 L 型 L 型因缺乏细胞壁 其致病性与无细胞壁的支原体和 病毒相似 主要引起间质性炎症 动物实验和临床呼吸道 L 型感染 或败血症 患者常出现间质性肺炎 与支原体肺炎相似 支原体和 L 型 都能引起泌尿生 殖道感染 现已证明溶脲脲原体和细菌 L 型均能吸附精子 与不育有关 细 胞培养时常加青霉素抑制杂菌的污染 但支原体仍能生长 并有诱导污染细 菌变为 L 型的可能 而支原体与 L 型的生物学特性极为相似 如变为多形性 能通过滤菌器 在固体培养基上菌落呈荷包蛋样或颗粒状 故在进行支原体 的分离鉴定时应当注意 两者的主要区别在于 L 型在脱离诱导因素后常可回 复为原来的细菌型 而支原体则是一种独立的微生物 在遗传上与细菌无关 表 17 2 支原体与细菌 L 型的区别 支原体 L 型 1 在遗传上与细菌无关 1 与原菌相关 常可以回复 2 细胞膜含高浓度固醇 2 细胞膜不含固醇 3 在一般培养基中稳定 3 大多需高渗培养 4 生长慢 菌落小 直径 0 1 0 3mm 4 菌落稍大 直径 0 5 1 0mm 5 液体培养混浊度极低 5 液体培养有一定混浊度 可粘 5 附于管壁或管底 第二节 主要致病性支原体 一 肺炎支原体 从正常人和动物呼吸道粘膜上可分离出多种支原体 其中肯定能引起人类 肺炎的只有肺炎支原体一种 引起的肺炎占非细菌性肺炎的 1 2 左右 支原 体肺炎的病理变化以间质性肺炎为主 又称原发性非典型肺炎 primary atypical pneumonia 肺炎支原体感染后症状较轻 仅有发热 咳嗽等呼吸道 症状 近年来经 PCR 技术证明有些喘息性哮喘 支气管炎与之有关 有时见 有呼吸道以外的并发症 如心血管症状 神经症状和皮疹 这可能与免疫复 合物的形成和自身抗体的出现有关 支原体肺炎主要经飞沫感染 大多发生 于夏末秋初 但一年中任何时间都可发生 发病率以 5 15 岁的青少年最多 肺炎支原体的诊断方法靠分离培养和血清学检查 肺炎支原体生长缓慢 早期诊断有赖于寻找抗原 1 分离培养 取可疑患者的痰或咽拭接种在含有血清和酵母浸膏的培养基中 用青霉素 醋酸铊抑制杂菌生长 初分离时生长缓慢 需要观察较长时间 长出的菌落没有明显周边 多次传代后生长加快 菌落成典型荷包蛋样 分 离的支原体可经形态 血细胞吸附 生化反应以及特异性抗血清作生长抑制 试验 GIT 进行鉴定 培养阳性率差 血清学诊断阳性者培养仅 64 阳性 2 血清学检查 临床上常用冷凝集试验 但仅 50 左右患者出现阳性 此 反应为非特异性 呼吸道合胞病毒感染 腮腺炎 流感等也可出现冷凝集素 效价的升高 补体结合试验和间接血凝等抗体测定方法仅在初次感染时出现 阳性 再感染时则不出现 原因是该试验主要检测的是 IgM 抗体 再感染时 IgM 不升高 临床诊断目前倾向于早期寻找抗原 方法有 应用单克隆抗体通过 ELISA 试验从患者痰 鼻洗液或支气管洗液中检测肺炎支原体分子量 43kDa 多肽或 190kDa 的 P1 蛋白 以特异性引物通过 PCR 技术从患者痰中检测肺 炎支原体 DNA 并可验证治疗效果 有报道经红霉素 氯霉素或螺旋霉素治 疗 2 3 周后 患者 PCR 全部转阴 肺炎支原体灭活或减毒活疫苗的应用效果尚不理想 二 泌尿生殖道感染支原体 6 引起泌尿生殖道感染的支原体主要有溶脲脲原体 人型 支原体和生殖器支 原体 这部分支原体在人体的定植可有二次上升趋势 在分娩时由母体产道 感染新生儿 以后迅速减少 但在成长后从性生活开始又渐增多 现已被列 为性传播性疾病的病原体 我国于 1986 年首次分离出溶脲脲原体 90 年代开始受到广泛重视 在非 淋菌性尿道炎 NGU 中 除衣原体外溶脲脲原体是一种很重要的病原体 1998 年有报道 3 年中 2197 例性病专科初诊为淋病或非淋菌性尿道炎 培养结 果淋球菌占 21 4 衣原体 35 9 溶脲脲原体 31 4 同年有报道性病 201 例中溶脲脲原体占 24 9 人型支原体占 2 0 溶脲脲原体和衣原体混合感染 65 2 淋病患者中溶脲脲原体检出率比非淋菌性尿道炎的溶脲脲原体高 2 倍 多 可能因淋病奈瑟菌损伤泌尿生殖道粘膜有利于溶脲脲原体的粘附 也是 淋病治愈后有些人仍有症状遗留的原因 生殖器支原体与非淋菌性尿道炎有 关 有人用 PCR 技术检测非淋菌性尿道炎 衣原体阳者尿中生殖器支原体 28 阳 性 而衣原体阴性者尿中生殖器支原体仅 7 正常人泌尿生殖道可有支原体 存在 但与患者比均有显著差异 生殖道的支原体感染对自然流产 出生缺 陷 死胎和不孕 育 均有关系 如自然流产 1 8 次的妇女宫颈分泌物或流 产组织中溶脲脲原体阳性率 68 其中流产 4 次以上者高达 80 而对照组 织仅 10 5 又如不孕者 69 例溶脲脲原体检出率 55 0 而对照 30 例检出率 26 6 溶脲脲原体可引起不孕 国内资料证明原因可能是多方面的 吸附于精子 表面 阻碍精子的运动 产生神经氨酸样物质干扰精子和卵子的结合 与精子 有共同抗原成分 对精子 可造成免疫损伤 国内报道 2181 例不育 孕 男女 溶脲脲原体检出率明显高于正常生育对照组 经强力霉素为主的治疗后 83 7 转 阴 其中恢复妊娠者占 38 7 溶脲脲原体的分离可用加尿素和酚红的含血清支原体肉汤 肉汤内可加青 霉素抑制杂菌生长 溶脲脲原体具有尿素酶 可分解尿素产氨 使酚红变红 但培养液澄清 表示阳性 在固体培养基上用低倍镜观察 可见有微小的荷 包蛋样或颗粒样菌落生长 免疫斑点试验 IDT 是将待检材料滴加于硝酸纤 维滤膜上 干燥后加免疫血清 若两者特异性相应就不能被洗去 可用酶标 SPA 显色 表示阳性反应 此法可用于检