人参皂苷Rg1抗衰老作用可能与改变p16、cyclinD、CDK4的表达有关

研究原著 2 9 中国临床药理学 与治疗学 中国药 理学会主办 C N 3 4 1 2 0 6 R I S s N 1 I l 9 25 01 h t t p I l w w w I lg n e t 2 O O 4 J a n 9 1 2 9 3 4 人参皂苷 R g l 抗衰老作用可能 与改变 p 1 6 c y c l i n D C D K 4的表达有关 金建生 赵朝晖 陈晓春 朱元贵 曾育琦 李永坤 彭小松 师广斌 福建医科大学附属协和医院 福建省老年医学研究所 福州 3 5 0 0 0 1 福建 摘要目的 探讨人参皂苷 R g l 对抗三丁基过氧化 氢 f B 玎 P 诱导的 WI 一 3 8细胞衰老作 用及其可能细 胞周期调控机 制 方 法 将 WI 3 8细胞 随机 分为 4 组 用不 同剂量 R g l 预 处 理 从 3 0代 开 始 隔代 用 t B H P 作用 每次 l h 共 4次 诱导细胞衰老 从光 镜 透射 电镜观察细胞形 态及超微结构 流式细胞术 分析 G 期细胞 比例 以及 S A 一 一 半乳糖苷酶的细胞 化学染色 确定 R g l 的抗衰老作用 并采用免疫印 迹技术对 C D K 4 c y c l i n D 1 和 p 1 6等表达情况进行检 测 结果 R g l 预 处理组与单 纯 t B H P处理组相 比 细胞形 态体积 小 胞体不如后者扁平 次级溶酶体减 少 G 期细胞 比例 下降 S A 一 一 半乳糖苷酶 染色阳性 细胞百分比下降 说明 R g l 在 t B H P 诱导细胞衰老 模型中有抗衰老作用 进一步发现用 R g l 预处理 后 p 1 6 c y c h n D 1 表达水平降低 C D K 4表达水平增 加 结论 提示 R g l可能通过改 变细胞周期调控 因 子的表达而发挥其抗 t B H P 诱导的 WI 一 3 8 细胞衰老 作 用 关键词 人参皂苷 R g l p 1 6 c y c li n D C D K 4 衰老 三丁基过氧化 氢 中图分类号 R 2 8 5 5 文献标识码 A 文 章 编 号 1 0 0 9 2 5 o l 2 O 0 4 0 l 0 0 2 9 o 6 许多研究表明细胞衰老是细胞周期调控下多基 因参与的复杂的病理生理过程 具有一定的可控性 2 0 0 3 0 6 2 6收稿2 0 0 3 0 7 1 8 修 回 福建省 自然科学基金项 目 N o C 0 2 1 0 0 1 7 陈晓春 通讯作者 男 教授 博士生导师 研究方向 神经系统变性疾 病和 衰老 的分子机制 T e l 0 5 91 3 3 7 7 6 酗 E ma i l x c c h e a 3 2 9 s o h u c 咂n 金 建生 女 副教授 硕 士生导 师 研 究方 向 老年 肾脏 病和 衰老 的分 子机制 参与细胞 周期 调控 的主要 分 子有 细 胞周 期 蛋 白 c y c l i n 细胞周期蛋 白依赖激酶 c D K 磷酸化酶 和细胞周期蛋 白依赖激 酶抑制蛋 白 C D I 等 其 中 p 1 6 与 c y c l in D C D K复合物的相互作用 可使细胞 阻滞在G l 期L 1 J 是细胞衰老周期调控的一个重要环节 现代药理研究认为人参具有抗衰老 抗氧化 提 高免疫力和增强记忆力等作用 J 本实验以 t B H P 三丁基过氧化氢 t e r t b u t y l h y d r o p e mx i d e 诱导 一 3 8 细胞衰老为模型L3 J 用人参皂苷 R g l 预处理 一 3 8 细胞 观察人参皂苷 R g l 是否具有抗衰老作用 同时应用免疫印迹技术 探 讨人参皂苷 R g l的抗衰 老作用是否与 p 1 6 C D K 4和 c y c l i n D1 等细胞周期调 控分子有关 1 材料和方法 1 1 药物 与试 剂 WI 3 8细胞是人胚肺 成纤维细 胞 由美国 A T C C细胞库提供 A T C C号 C C L 7 5 培养基 在 含 1 0 的胎牛 血清 美 国 G i b c o公 司产 品 的 M E M G i b c o 中加 入 2 m m o l L 谷氨 酰胺 1 0 m m o l L 丙酮酸钠 0 1 m m o l L 非必需氨基酸 和 1 5 g L 碳酸氢钠 t B HP购 自 S i g m a公司 碘 化丙啶购 自 B D公 司 核 糖核酸 酶 鼠抗人 p 1 6单 克隆抗体购 自 B D P h a r m i n g e n 公 司 鼠抗人 c y c l i n D l 单克隆抗体购 自N e o M a r k e r s 公司 兔抗鼠 C D K 4 多克隆抗体购 自 C h e m i c o n公司 一 半乳糖苷酶细 胞化学染色试 剂盒 We s t e rn B l o t 化学 发光检 测试 剂盒购 自美国 K P L公司 1 2 仪器c 2 培养箱为美国 F o r m a S c i e n t i fi c 公司 产品 低温离心机和 D U 6 4 0型紫外分光光度计 为美 国 B e c k ma n公 司产品 A l p h a E n l a g e r 2 2 0 0型 图像 分 析仪购 自美国安莱公司 倒置显微镜为 日本 O l y m p u s C K 4 0 流式细胞仪购自B D公司 1 3 实验分组和处理WI 一 3 8 细胞从第 2 4代开始 维普资讯 3 0 与人参皂苷 R g l共同培养 按 人参皂苷 1不 同的 终作用浓度将 细胞分为 4组 单纯 t B H P处理组 仅用 ME M培 养液 不加 人参 皂 苷 R g l 5 t ma o l L R g 1 预处 理组 ME M培养液 5 t m a o l L R g 1 共 培 养细胞 1 0 t m a o l L R g l预处理组 ME M培养液 1 0 t ma o l L R g l 共培养细胞 2 0 p m o l L 1 预处 理组 M E M 培养液 2 0 t m a o l L r g l共培养 细胞 所有的细胞从第 3 0代开始 每 2代用 1 0 0 to o l L t B H P诱导作用 1 h 用 M E M 培养液冲洗 2遍后放 人 C O 培养箱修 复 2 d再 1 4传代 t B HP共作 用 4次 然后按不同的实验要求处理细胞 各组设 5个平行对照 1 4 倒置显微镜下观 察 WI 3 8细胞 的形 态 在 6 孔板 中预先置入 已铺 过多聚赖氨酸 的玻璃盖片 接 种分组处理 的细 胞悬液 培 养 2 4 h 第 2天取 出盖 片 用 4 预 冷 的 0 O 1 to o l L P B S冲洗 细 胞 2 次 置倒置显微镜下观察拍照 1 5 透 射 电镜观 察 WI 3 8细胞 的超微 结 构 用 0 2 5 胰酶消化后收集细胞 用 4 预冷的 P B S p H 7 4 离心洗 细胞 2次 弃去 上清液 加入 4 预冷 的 3 戊二醛一 1 多聚 甲醛 固定 4 h以上 P B S 漂洗 3次 每次 1 0 m i n 在 1 锇酸 4 下后 固定 2 h 漂洗 3次 室温下用 乙醇 丙酮逐级脱水 环 氧 树脂 6 1 8浸透 包埋 超薄切片用醋酸铀 枸橼酸铅 双染色各 1 0 m i n H U 一 1 2 A型透射电镜观察拍照 1 6 流式细胞 术对 WI 3 8细胞进行周期 分析 常 规分组 培养细胞 用 0 2 5 的胰 酶消 化 然 后 P B S 反复吹打成单细胞悬液 离心 弃上清 将细胞密度 调整 为 1 l o 6 m l 在 1 0 0 l样 本 液 中 加 入含 5 0 n a g L 碘化丙啶和 5 0 n a g L 核糖核酸酶 的染液 5 0 0 避光 3 7 孵育 3 0 m in 用流式细胞仪采集 数据进行细胞周期分析 计算 G 期细胞比例 1 7 S A 半乳糖苷酶细胞化学染色在 6孔板 中 预先置人 已铺 过多聚赖氨酸 的玻 璃盖片 按 7 0 0个 每 c m 2细胞 密度 接种 分组 处 理 的细胞 悬 液 培 养 2 4 h 第 2天取 出盖 片 用 4 预冷 的 P B S冲洗细 胞 2次 然后用 4 预冷 的 2 甲醛 0 2 戊二醛 固定 5 m i n P B S冲洗细胞 2次 用 S A 一 一 半乳糖苷酶 反应液 3 7 孵育 3 4 h 其后用双蒸水冲洗 2 次 后 固定 4 m i n 后固定液 7 0 乙醇 福 尔马林 冰醋 酸按 2 0 2 1 比例混合 流水轻轻冲洗 然后用核 快红复染 细胞核 梯度 乙醇脱水 二甲苯透明 阿拉 伯树胶封固 每张片子计数 4 O O个细胞 确定 S A 半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比 C la i n J Cl i n P h a r ma c o l T h e r 2 0 0 4 J a n 9 1 1 8 We s t e r n B l o t 测定蛋白表达水平将要收集的 WI 一 3 8 细胞提前 2代 1 4接种于 6孔 板上 待细 胞数增 长至接种前 4倍时 用 4 预冷的 P B S轻洗 2次 加 入 预 冷 的 细 胞 裂 解 液 1 N P 4 0 5 0 mmo l L一 s pH 7 5 1 5 0 mmo l L Na e l 1 mmo l L P MS F 0 0 2 n a g ml a p r o t i n i n l e u p e p t i n a n d p e p s t a t i n 3 0出 冰浴 5 m i n 用细胞刮将细胞从 培养板上刮下 4 离心 1 0 m i n 吸上清液 一8 0 保存 蛋白质定量后加等量 2 样品缓冲液 1 0 0 水浴 5 m i n 5 0 0 0 r m i n 离心 1 0 S 取上清液上样 取样品 1 0 0 孔 用 1 2 S D S聚丙烯酰 胺凝 胶 电泳分离 分离 的蛋 白转膜至硝酸纤维膜后 室温 封闭液封闭 1 h 与一抗 浓 度 1 g L 4 过夜 洗膜 4次后 与二抗 1 l O O O 室温下摇育 2 h 洗膜 4次后 用化学发光显色系统 显示 蛋 白条带 曝光在 柯达胶片上 每次实验重复 5次 曝光在柯达胶片 上条带 用 图像分析仪扫描 并计算点密度 与 口 一 a e t i n内参照 一抗浓度为 0 2 t g m l 相 比 1 9 统计学处理实验结果以均值 标准差 x s 表示 采用 S P S S 8 0软件包分 析 多组 间 比较用 单 因素方差分析 2 结 果 2 1 倒 置显 微镜 下 WI 3 8细胞 的 形态 单 纯 t B H P处理组 WI 一 3 8细胞 体呈梭形或不 规则三角形 中央有卵圆形核 胞质 向外伸 出多个长短不 同的突 起 体积增大 胞体变平 而用人参皂苷 r g l 预处理 的细胞体积 比单 纯 t B H P处理组小 胞体不如单纯 t B H P处 理组扁平 这种 变化 1 0 t m a o l L R g l预 处理组要 比 5 t m a o l L R g l 预处理组来得 明显 而 2 0 l o l L r g l预处 理组 与 1 0 t m a o l L R g l预处 理组相比没有明显差别 2 2 透射电镜下 WI 3 8细胞 的超微结构 单纯 t B H P 处理组WI 一 3 8 细胞体积较大 核呈梭形或椭 圆形 核仁可见 胞浆内见较多粗面内质网 线粒体 多数细 胞 浆 内次级溶酶 体 包括脂 褐素 明增 多 图1 A 用人参皂苷 R g l预处理与单纯 t B H P处理组相 比 细胞浆 内次级溶酶体 包括脂 褐素 明显减少 其 中 1 0 l o l L R g l预 处 理 组 图 1 C 比 5 t m a o l L R g l 预处理组 图 1 B 明显 而 2 0 t ma o l L R g l 预处 理组 图 1 D 与 1 0 t m a o l L R g l 预处理组相 比没有 明显变化 但 2 0 t m a o l L r g l 预处 理组 出现细胞 浆 内线粒体有不 同程度肿胀 线粒体有减少 或消失 成空泡状 部分细胞浆 内脂肪滴增多 维普资讯 主国l 理堂与治疗学 2 0 0 4 J a n 9 1 3 1 图 1 单纯三丁基过氧化氢 t B l i P 处理组和不同浓度人参皂苷 R g 1 预处理组电镜图 A 单纯 一 B l I P处理 组 6 0 0 B R g l 5 tn n o l L 一 预 处理 组 3 6 0 0 c R g l 1 0 t n n o l L I 预 处理组 3 6 0 0 D R g l 2 0 t n n o l L一 预 处理 组 2 4 O 0 2 3 WI 3 8细胞的周期分析结果如 图 2所示 单 纯 t B H P 处 理 组 G 期 细 胞 百 分 比 为 8 6 3 3 2 5 1 0和 2 0 f a n o l L R g 1 预处理组 G 1 期细 胞百分 比分别 为 7 9 9 1 8 6 9 6 2 4 和 7 4 6 1 6 各 R g 1 预处理组 的 G 期细胞百分 比均比单纯 t B H P处理组降低 差别有显著性意义 P 0 0 5 其 中尤 以 1 0 l a n d L 1预处理组 的 降低最 为明显 图 2 各组 G 期细胞 百分 比 与单纯三丁基过氧化氢 一 B I 组比较 P 0 晒 R g l 浓度单位为 n L 一 2 4 WI 3 8细胞的 S A 半乳糖苷酶细胞化学染色 如图 3所示 单纯 t B H P处理组 S A 一 半乳糖苷酶染 丑 妞 g 碧 器 医 组别 图3 各组 s A 卢半乳糖苷酶染色阳性细胞数的百分比 一弹 纯三丁基过氧化氢 f B 组比较 P 0 O 1 R g l 浓度单位为 1 d LI 1 色阳性细胞 数的百分 比为 9 3 1 2 0 5 1 0和 2 0 t m o l L R g l 预处理组 S A 一 半乳糖苷酶染色 阳 性细胞数的百分 比分别 为 5 4 3 4 2 4 0 2 2 8 和 4 o 5 2 4 各 R g 1 预处理组的 S A 一 半乳糖苷酶染色 阳性细胞数均 比单纯 t B H P处理组 维普资讯 3 2 明显减低 差别有极显著性意义 P 0 0 1 图 4为 S A 一 一 半乳糖苷酶染色阴性细胞 图 5为 S A 半乳 糖苷酶染色阳性细胞 图 4 S A I 半乳糖苷酶染色阴性的细胞 4 0 0 图 5 S A 半乳糖苷酶染色阳性的细胞数 4 0 0 半乳糖苷酶染色阳性细胞浆呈青绿色 如箭头所示 2 5 p 1 6与 e y d i n D1蛋白表达水平的变化从图 6 7 可以看出单纯 t B H P处理组 p 1 6蛋白与 c y c li n D 1 蛋白表达水平最高 用人参皂苷 R g 1 预处理后 p 1 6与 c y c l i n D 1 蛋 白表达 水平明显下降 下 降程度 与人参皂苷 a g l 的预处理浓度的增高呈剂量依赖性 关 系 其 中以 2 0 t t m o l L a g l 预处理组 p 1 6与 c y c l i n D 1 蛋 白表达水平下降最明显 l 2 3 4 I l 2 3 4 fl a c t i n c y c n n D 1 舞 I 枷 n CD 一 tin 图 6 We s t e r n B l o t 测 定 p 1 6 c y c l i n D 1 C D K 4蛋 白表达 水平 2 6 C D K4蛋 白表达水平的变化从 图 6 7可以 看 出单纯 t B H P处理 组 C D K 4蛋 白表达 水平最低 用人参皂苷 R g l预处理后 C D K 4表达水平上 升 随 人参皂苷 R g l的预处理浓度呈剂量依赖性变化 以 C h i n J C h n P h a r ma c o l T h e r 2 0 0 4 J a n 9 1 2 0 ml o l L R g l 预处理组 C D K 4表达水平上升最 为 明显 1 0 0 8 g 善 0 6 a c L 0 4 0 2 0 0 p1 6 c yc l i n DI 图 7 各蛋自与 i a e a 的比值 3 讨论 WI 3 8细胞是 人胚肺 成纤 维细胞 在体 外培 养 时经历一定次数的群体倍增后 日趋成为对生长因 子没有反应能力的衰老 的细胞群 具有胞体增大 变 平 次级溶酶体 包括脂褐素 明显增多 细胞生长阻 滞于 G 期 S A 9 半乳糖苷酶表达增加 等衰老细胞 的特征性改变 本研究采用 t B H P 通过氧化应激的 方式已成功地诱导细胞衰老的模型 本实验应用 t B H P诱导的细胞衰老模型来研究 人参皂苷 R g l 的体外抗 衰老 作用 结果 显示与单纯 t B H P处理组相 比 R g 1预处 理组 细胞 的形态体 积 小 胞体不如其扁平 细胞次级溶酶体 包括脂褐素 减少 G 期细胞 比例下 降 S A 1 9 半乳糖苷酶染 色阳 性细胞百分比下降 提示人参皂苷 a g l 在体外 有很 好的抗衰老作用 此外 本实验 2 0 t m o l L 人参皂苷 a g l 预处理 组出现细胞浆内线粒体有不同程度肿胀 线粒体有 减少或消失成空泡状 部 分细胞浆 内脂肪滴增多 而 细胞浆内次级溶 酶体 包括 脂 褐素 G 期 细胞 比 例 S A l9 半 乳 糖 苷 酶 染 色 等方 面 与 1 0 a n o l L l 预处理组相 比没有 明显减少 说 明在细胞培养 水平上 1 0 m 0 卜L 人参皂苷 a g l已有很 好的抗 衰 老效果 加大剂量并不能增强抗衰老的作用 却会产 生一定的毒性作用 这与陈晓春等报道人参皂苷 R g l 对 P C 1 2细胞 的凋亡保护作 用 的最 佳作用 剂量 相一致 p 1 6 c y c l i n D 1和 C D K 4是细胞周期调控 的重要 分子 c y c l i n D 1与 C D K 4结合 使 C D K 4激活 活化 维普资讯 中国临床药理学与治疗学 2 0 0 4 J a n 9 1 的 C D K 4可使 R b磷 酸化 磷 酸化 R b与 E 2 F D P 1杂 二聚体分离 失去 了抑 制 E 2 F启动 D N A合成 的作 用 从而使细胞 由 G 期进入 s期 c y c l i n D 1 合成 和激活所导致的 R b蛋 白磷酸化 将在 G 期 末期形 成一个 负反馈 关闭 c y c l i n D 1的表 达 C y c l i n激活 C D K 4的过程可通过 p 1 6与 C D K竞争性结合 而受到 抑制 即 p 1 6 一 C D K 4复合物不 能使 R b磷酸化 使 R b 正常地 行 使 G 期 阻滞 功 能 从 而抑 制 细 胞 的增 殖 本研究结果证实在 t B l I P诱导 的 wI 一 3 8细胞衰 老模型 中 存在 p 1 6和 c y c l i n D 1表达水平 的增加 C D K 4表达水平的减少 待发表 这些改变与成纤维 细胞 正常衰老时所表现的情形相一致L 1 m J p 1 6量 的积累是作为生命末期引发的终点程序的一部分 维持衰老阻滞 佗 它能特 异地 与 C D K 4结 合 阻 止 C D K 4 与 c y c l in D形成复合物 抑制 c y c l i n D C D K 复合物酶的活性 使细胞阻滞在 G 期 使 c y c l in D 1 合成没有受到负 反馈调节 而表达增加 同时 一方 面 C D K 4水平下 降 另一方面 p 1 6抑制 C D K 4的活 性 阻断转录抑制 因子 R b的磷酸化 导致 与 R b蛋 白结合 的转录活化因子 E 2 F 1 不能释放 使细胞循环 至 S期所必需的许多重要基 因不能激 活 引起细胞 生长阻滞于 G 期 从 而诱 发 细胞衰 老 的特征 性改 变 而用 人参皂 苷 R g l预处理 后 p 1 6和 c y c l i n D 1 表达水平下降 C D K 4表达水平上升 这种改变随人 参皂苷 R g l 预处理浓度增高 而呈剂量依 赖性变化 一 方面 提示人参皂苷 1 抗 衰老作用 与 p 1 6表 达 水平下 降 C D K 4表达水 平上 升有 关 而 c y c l i n D 1 表达水平下降的原 因可能是 由于 p 1 6表达水平 的降 低 减少对 c y c l i n D C D K复合物酶活性 的抑制 减少 细胞在 G 1 期的阻滞 使 c y c l i n D 1 合成受到负反馈调 节从而表达水平下降 另一方面 除细胞周期调控机 制外 还有其它调控 机制发挥作用 而本实验为进 一 步证实中药人参的抗衰老作用提供必要的实验依 据 并从细胞周期调控方面探讨人参皂苷 R g l 抗衰 老的可能机制 参 考 文 献 1 O h n i N Z e b e d e e Z Hu o t T J a o p t i n g e ff e c t s o f E t s 3 3 a n d I d pr o t e i n s o n pl 6 I NK4a e x p r e s s i o n d u r i n g c e l l u l a r s n e s e e n e e l J j N a t u r e 2 0 0 l 4 0 9 l 0 6 7 7 0 2 Z h a n g J r r AF 1 5 0 S a n d A F 2 6 7 B Ml mu s e a r i n i c a g o n i s t s a s i n n o v a t i v e t h e r a p i e s f o r h e i m e r s d i s e a s e J J M o l N e u m s ci 2 0o 2 1 9 l 45 5 3 3 C o e k c r o f t V G R o s s G J B P e d d e mo r s VM Di s t r i b u t i o n a n d s t a t u s o f b o t t l e n o s e d d o l p h i n t u r s i o t r u n e a t u s o n t h e s o u t h c o a s t o f N a t a l S o u 山 A f ri c a l J J S o u 山 A ti i J Ma r i n e l 9 9 l l l 20 3 9 4 Di mr i GP g e e X B a s i l e G e t A b i o ma r k e r t h a t i d e n t i fi e s s n e s e e n t h u m a n c e l l s i n c u l t u r e a n d i n a n g s k i n n v v o l J J Pr o c Na t l Ac a d S e i US A 1 9 9 5 9 2 9 3 6 3 7 5 h e nXC Z h uYG W a n g XC P r o t e c t i v e e ff e c t o f g i n s e n o s i d e R g l o n d o p a m i n e i n d u c e d a l p t o s i s i n P C l 2 c e l l s l J J A c t a Ph a r ma c o l S i n 2 x 1 2 2 6 7 3 8 6 S h e r r C J G l p h a s e p r o g r e s s i o n c y c l i n g o n c u e J J C e l l 1 9 9 4 79 5 5l一5 7 l e e B i e l a w s k a AE Ob e i d L M R e g u l a t i o n o f c y c l i n d e p e n d e n t k i n a s e 2 a e t i v i t Y b y c e r a m i d e J J E x p C e U R e s 2 0 0 0 2 6l 3 03一 l l 8 S a n d h u C P e e h l D M S l i n g e da n d J p l 6 I NK 4 A me d i a t e s e y e l i n d e p e n d e n t k i n a s e4 a n d 6 i n h i b i t i o n i n s e n e s c e n t p r o s t a ti c印一 i t h e l i a l c e l l s J C a n e e lr R e s 2 0 0 0 6 0 2 6 1 6 2 2 9 S a n d h u C D o n o v a n J B h a t t a e h a r y a N e t a Re d u c t i o n o f C d c 2 5 A e o n t r i b u t e s t o c y c l i n E 1 一 C d l 2 i n h i b i t i o n a t s e n e s c e n c e i n h u m a n m a I n 1 唧e p i t h e l i a l c e l l s J O n c o g e n e 2 0 0 0 1 9 5 31 4 2 3 1 0 L u c i b e l l o F C S e w i n gA B r u s s e l b a c h S e t D e r e g u l a t i o n o f c y c l i n s D1 a n d E a n d s u p p r e s s i o n o f e d it 2 a n d c d k 4 i n s e n e s c e n t h u m a n ti b r o b l a s t s J J C e l l S e i 1 9 9 3 1 0 5 P t 1 1 2 3 3 l 1 B r o wn J P We i W S e d i v y J M B y p a s s o f s e n e s c e n c e a f t e r d i s r u p t i o n o f p 2 1 C I P 1 wA F 1 g e n e i n n o r m a l d i p l o i d h u m a n fi b r o b l a s t s J j S e i e n c e 1 9 9 7 2 7 7 8 3 1 4 1 2 Dl l l i e V Be n e y GE Fr e l u r g G e t Un c o u p l i n g b e t we e n p h e n o t y p i c s n e s e e n e e a n d c e l l c y c l e a r r e s t i n a g i I 1 g p 2 1 一 d e ft c i e n t fi b r o b l a s t s J M o l C e l l B j 0 l 2 0 0 0 2 0 6 7 4 1 5 4 1 3 l d h u C D o n o v a n J B h a t t a e h a r y a N e t R e d u c t i o n o f C d c 2 5 A e o n t r ib u t e s t o c y c l i n E 1 一 C d k 2 i n h i b i d o n a t s t l e s c e n c e i n h u m a n m a I n 1 唧e p i t h e l i a l c e l l s J O n c o g e n e 2 0 0 0 1 9 5 31 4 2 3 1 4 L u c i b e l l o F C S e wi n gA B r u s s e l b a c h S e t D e r e g u l a t i o n o f c v c l i n s D1 a n d E a n d s u p p r e s s i o n o f e d i t 2 a n d c d k 4 i n s e n e s c e n t h u m a n fi b r o b l a s t s J J C e l l S e i 1 9 9 3 1 0 5 P t 1 1 2 3 3 3 1 5 ld h u C P e e h l DM S l i n g e r l a n d J p l 6 I N K 4 A m e d i a t e s e y e I i n d e p e n d e n t k i n a s e 4 a n d 6 i n h i b i t i o n i n s e n e s c e n t p r o s t a ti c e p i t h e l i a l c e l l s J C a n c e r R e s 2 0 0 0 6 0 2 6 1 6 2 2 维普资讯 3 4 C h i n J Cl i n P h a mr a c o l T h e r 2 0 0 4 J a n 9 1 An t i a g i n g e f f e c t o f g i n s e n o s i d e Rg l i s r e l a t e d wi t h t h e e x p r e s s i o n o f p 1 6 c y c l i n D1 a n d CDK4 J I N J i a n S h e n g Z HA O C h a o H u i C H E N X i a o C h u n Z H U Y u a n G u i Z H E N G Y u Q i L I Y o n g K u n P ENG Xi a o S 0 n g S HI Gu a n g Bi n T h e A f fil i a t e d H o s p i t a l F u j ian Me d i c a l U n i v e r s F u j ia n I n s t i t u t e o f G e r i a t r ic Me d ic i n e F t t z h o u 3 5 0 0 0 1 F u 一 n Ch i n a ABSTRACT AI M To i n v e s t i g a t e t h e a n t i a g i n g e ff e c t s o f g i n s e n o s i d e Rgl a n d the p o s s i b l e me c h an i s m o f c e l l c y c l e i n s e n e s c e n c e mo de l i n d u c e d b y t e r t b u t y l h y d r o p e r o x i d e t B H P M I D S WI 一 3 8 c e l l s w e r e d i v i d ed i n t o 4 g r o up s an d r a n d o ml y a d d ed wi th d i ffe r e n t c o n c e r