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生物物理技术章 根据吸收光谱确定物质2 浓度测定3 化学反应的检测4 分光光度滴定5 构象研究6 结合研究7 差光谱应用 一 基本应用 许多物质都有其自身的特征吸收光谱 因此根据吸收光谱可以辨认溶液中是否含有某种特定物质 1 根据吸收光谱确定物质 附表中为生物医学研究中常见的各种物质在中性pH下的吸收峰与摩尔吸收系数之值 测量时可以作出全谱 或者测不同波长下吸收度之比 例 测出吸收度A 则在 已知的条件下即可算出浓度 为避免非线性因素的影响 应先用标准样品做一条校正曲线 然后测量样品吸收度 在校正曲线中直接读出浓度 2 浓度测定 有些不易测吸收的物质可通过化学反应使其转变为易测物质之后再行测定 例 如果样品中含有两种吸收物X和Y 如何测其浓度 可在两个不同波长下测吸收度 得 3 化学反应的检测 如果化学反应中的一种反应物在反应过程中其浓度随之改变 则分光光度法可用于研究这种反应 这在研究酶反应中是经常应用的一种方法 例 研究蛋白质结构时常需了解蛋白质与其可电离的氨基酸侧链解离时的pK值 这些值常能说明氨基酸在蛋白质中所处的位置 因为解离将使其中某一种氨基酸基团的谱改变 一般来说 可滴定基团 如酪氨酸的OH基 组氨酸的咪唑环 半胱氨酸SH基 带电时 max与 值增大 例 4 分光光度滴定 大分子在不同条件下的溶液构象研究是分子生物学中的一项重要课题 利用构象改变时吸收谱的变化可以作为一种研究手段 如前面提到极端pH条件下蛋白质的变性 就常表现在吸收度的变化上 5 构象研究 DNA在不同温度下A260逐渐变大 被称为增色性 这是由于二条多核苷酸链连续分离 以致DNA中碱基不再堆积而造成的 用这种方法可以研究温度 pH 离子强度和外加小分子对DNA稳定性的影响 DNA的一些重要性质即用此法解释 例 小分子与蛋白质结合 如一种酶的基质与酶活性部位的结合常使活性部位中 或附近 的吸收基团产生光谱变化 这种变化常由于结合使基团暴露于溶剂或该区极性受影响所致 把所观察到的变化和改变溶剂所得结果比较 可得到活性部位结构的信息 例 6 结合研究 研究生物大分子溶液时 光谱对环境条件的依赖性常常很小 但这种微小差别却能说明大分子的构象变化 这时通常用双光束 吸收谱仪直接测定不同环境条件引起的差异 而不是对每一样品分别测量 其具体办法是将一个样品放在参比光路中 而将另一个放在样品光路中 这时谱仪对二者之差作出反应 所得之谱即称为差光谱 7 差光谱应用 可定义差摩尔吸收系数 为 A cl 环境的改变可用多种方法 但溶剂组成与pH的改变给出的信息最多 例 二 临床应用举例 1 人血液不同成分吸收光谱探讨 2 肝脏占位性病变患者血清 L 岩藻糖甙酶活性测定及其临床意义 中华物理医学杂志 1998 20 1 26 林上忠 陈荣 许少锋 问题的提出 为什么要做这项实验 近年来激光照射血液治疗方法在国内外逐步应用于临床 如有报道激光照射血液治疗可抗缺氧 纠正脂代谢异常 对血液流变学性质 血液的力学和微循环有改善作用 对机体免疫功能有调节作用等 1 人血液不同成分吸收光谱探讨 这些变化应与血液中的红细胞 血红蛋白 血小板 淋巴细胞等成份吸收激光照射的能量有关 人血液中不同成份的吸收光谱曲线有差异 吸收峰位也不相同 因此在激光照射血液治疗疾病时 选择不同波长的激光治疗不同类型的疾病 使相应的细胞或生物分子活化 对于提高疗效是有利的 如何设计实验 选择测量对象分离测量 结果 全谱峰位 血清吸收光谱血浆吸收光谱 血红蛋白吸收光谱白蛋白吸收光谱 红细胞吸收光谱淋巴细胞吸收光谱 血小板吸收光谱 2 肝脏占位性病变患者血清 L 岩藻糖甙酶活性测定及其临床意义 中华医学检验杂志 1990 13 1 2 杨甲梅等 问题的提出 为什么要做这项研究 随着现代影像诊断技术的发展 肝脏占位性病变 SOL 的发现日渐增多 但是对其定性诊断比较困难 尤其是甲胎蛋白 AFP 阴性肝细胞癌 HCC 与肝脏其它SOL的鉴别诊断更是亟待解决的课题 研究方法 对已确诊的203例各种肝SOL患者及50名正常人血清 L 岩藻糖甙酶 AFU 活性进行测定 以寻找AFP以外的HCC生物标记物 试剂 对硝基苯基 L 岩藻糖吡喃甙 pNP L fuco 对硝基酚 pNP 仪器 721型分光光度计 原理 pNP L fuco被AFU水解产生pNP在波长为405nm处有吸收峰 1ml反应体系 0 25ml血清 0 25ml4mmmol LpNP L fuco0 5ml0 2mol lph5 2醋酸缓冲液混合后 37 60min加中止液室温4000r min 15min取上清比色 以每毫升血清中的AFU将底物pNP L fuco水解释放的pNP的量为相应酶活性单位 另外做出pNP的标准曲线 结果 吸收光谱术的物理基础 吸收光谱仪的基本构成 吸收光谱术的基本应用 注意从学习过的应用实例中总结如何发现问题分析并加以解决问题 以及解决问题时思路拓展的方法 第二章小结 芳香氨基酸的紫外吸收光谱 胞嘧啶谱与pH的关系 附表几种物质的吸收峰与e值 早期测DNA碱基组分时 将DNA水解 并用层析法分离碱基 然后分别测各种碱基的 max 也可测250nm与280nm处吸收度之比 腺嘌呤2 00鸟嘌呤1 63胞嘧啶0 31确定碱基后再用测浓度的方法测出每种碱基的量 乙酰乙酸盐 丙酮的测定在诊断苯酮尿症病人时很有用的 测血或尿中这些代谢物的总浓度时可加苯胺催化乙酰醋酸盐为丙酮 然后用水杨醛处理 强碱条件 形成红色二羟苄基苯酮 以一系列标准丙酮溶液 在每100ml含0 8mg范围内 作上述处理 作出标准曲线 再测样品即可读出其浓度 在分子生物学中研究乳糖操纵子时常需测 半乳糖苷酶的活性 此酶可使o 硝基苯半乳糖苷 ONPG 断裂 形成o 硝基苯 可用其在420nm下的吸收检测 因此 420 或A420 是ONPG水解的量的一种量度 在一定范围内 反应速度与酶浓度成正比 所以酶的量可从A对水解时间所作图的斜率求出 若一蛋白质含有五个酪氨酸残基 并都在蛋白质表面 则改变pH时酪氨酸谱将向长波方向移动 因此 295 电离形式酪氨酸的 max在295nm 对pH的关系应如图中曲线A 假如有3个酪氨酸残基在蛋白质内部 并处于非极性环境 则应如曲线B 而且第一平台和第二平台的高度比应为2 5 但在pH值很大时常引起蛋白质变性 这时处于内部的酪氨酸也暴露于溶剂 故A295有较大上升 如内部3个酪氨酸残基处于极性环境 则得曲线C 表明这3个酪氨酸的pK值和处于表面的2个有所不同 酪氨酸滴定曲线 DNA的热稳定性随鸟嘌呤 G 胞嘧啶 C 含量增多而增大 图 所以G C对氢键合程度比腺嘌呤 A 胸腺嘧啶 T 对强 这可从图中看出 由于转变发生在较窄的温度范围内 故常称为DNA的融解 融解温度 Tm 定义为最大吸收度一半处的温度 G C对越多 Tm越大 此外温度上升到不超过最大吸收然后降温到A不再改变 这时的A值仍为原始A值 这表明双链分解不完全时仍有可能恢复至天然结构 三种DNA溶液光密度与温度的关系 把各种小分子加到溶菌酶中使色氨酸的 max移向长波区 改变的大小和一个色氨酸从极性向非极性环境转变时预期应有的变化相同 这就暗示活性部位有一个色氨酸存在 最早的差光谱就是对核糖核酸酶做的 从图可见在287nm处酪氨酸差光谱有峰 而色氨酸则为0 因此在此波长下的测量只反映酪氨酸残基的变化 而核糖核酸酶有6个这样的残基 附图是用乙二醇和蔗糖两种微扰溶剂所做的工作 其结果用各种