谷氨酸液体发酵

发酵工程实验 论文 谷氨酸液体发酵谷氨酸液体发酵 摘要摘要 目的目的 学习实验室发酵罐谷氨酸液体发酵 方法方法 用分光光度计测定发酵过程中 发酵液的还原糖和谷氨酸的浓度 结果结果 没能得到谷氨酸发酵的理想曲线 结论结论 本实验 结果并不理想 但我们已经对快速检测发酵进程有了基本了解 关键词关键词 谷氨酸液体发酵 谷氨酸棒杆菌 质量控制 1 材料与方法材料与方法 1 1 谷氨酸菌种制备及扩大培养 1 1 1 一级种子培养 基配制 培养目的在于制备大量高活性的菌体 培养基配方 如下 葡萄糖 2 5 尿素 0 5 硫酸镁 0 04 磷酸氢二钾 0 1 玉米 浆 3 硫酸亚铁 2ppm 硫酸锰 2ppm 1000mL 三角瓶中装 300mL 培养基 每组 3 瓶 0 1MPa 灭菌 30 分钟 冷却后接种 接种量为一支斜面接一瓶 30 32 摇床培养 12 小时 1 1 2 二级种子培养 基配制 培养目的 是制备和发酵罐体积及培养条件相称的高 活性菌体 1000ml 三角瓶装 300ml 培养基 每组 3 瓶 0 1MPa 灭菌 10 分钟 冷 却后接种 摇床培养7 8 小时 培养基配方 葡萄糖 2 5 尿素 0 34 磷 酸氢二钾 0 16 糖蜜 1 16 硫酸镁 0 043 消泡剂 0 01 pH 7 0 1 1 3 接种 接种一级种子 用接种环从斜面菌种刮取少量菌种到接种瓶中 之 后用移液器移取菌种到二级种子培养瓶中 1 1 4 并种 将每 3 瓶二级菌种无菌合并在1000mL 的三角瓶里 放入冰箱待用 1 2 发酵培养基制备 按工艺要求配制发酵培养基 10 升发酵罐定容 6 升 实际配料时 定容到预定体积的 60 左右 即 10 升发酵罐定容 4 升 另 40 体积为蒸汽冷凝水和种子 液预留 培养基配方 葡萄糖 13 硫酸镁 0 06 磷酸氢二钾 0 1 糖蜜 0 3 硫 酸锰 FeSO4 各 2ppm 氢氧化钾 0 04 玉米粉 0 125 消泡剂 0 5 调整 pH 为 7 0 尿素配成 40 浓度 装在 1000mL 瓶中 每一瓶装 800mL 分消备用 消泡剂配成 1 浓 度 分消备用 1 3 发酵培养装置消毒及培养过程控制 空气过滤器及空气管路的消毒 发酵罐空消 电极校正 发酵罐实消 接种发酵过程的温度控制及 pH 控制 1 5 还原糖测定 1 5 1 葡萄糖标准曲线制作 取 5 支 15mm 150mm 试管 按设计梯度加入 0 4mg ml 葡 萄糖标准液和蒸馏水 在上述试管中分别加入 DNS 试剂 2 0ml 于沸水浴中加热 2min 进行 显色 取出后用流动水迅速冷却 各加入蒸馏水 9 0ml 摇匀 在 540nm 波长处测定光吸 收值 以 1 0ml 蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点 以葡萄糖含量 mg 为横坐标 光吸收值为纵坐标 绘制标准曲线 1 5 2 样品中还原糖的测定 取 7 支 15mm 150mm 试管 分别按设计加入试剂 在发酵 罐中小心取样 然后 4000rpm 离心 5 分钟除去菌体细胞 加完试剂后 于沸水浴中加热 2min 进行显色 取出后用流动水迅速冷却 各加入蒸馏水 9 0ml 摇匀 在 540nm 波长处 测定光吸收值 测定后 取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量 1 8 谷氨酸测定 1 8 1 谷氨酸标准曲线制作 取试管 分别加入配制好的谷氨酸纯品溶液 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5ml 补水至 3ml 随后每只试管中加入 0 5mL 茚三酮试剂 塞上 PVC 胶塞 摇匀管内溶液 迅速置于 80 水浴锅中加热 15min 不停地摇动 快速取出保 发酵工程实验 论文 温到时的试管 将之插入冰浴锅中 静置 5min 不停地摇动 以蒸馏水为空白对照 测出 各浓度标准样品 OD569值 1 8 2 谷氨酸发酵液预处理 取谷氨酸发酵液于 11400 r min 离心 5 min 取上清液弃去 菌体 用蒸馏水稀释 100 倍 调节 pH 5 5 6 后备用 1 8 3 发酵样品谷氨酸含量检测 取 3 mL 预处理好的发酵液加入 18mm 180mm 玻璃试 管中 调整发酵液 pH5 5 左右 沿试管壁加入 0 5mL 茚三酮试剂 塞上 PVC 胶塞 将试管 中液体振匀 迅速置于 80 水浴中加热 15min 快速取出保温到时的试管 放入冰浴锅中 静置 5min 将分光光度计波长调至 569nm 处 以 100 倍稀释的空白液体发酵培养基为空 白对照 测出 OD569值 2 实验结果实验结果 2 1 还原糖测定 2 1 1 葡萄糖标准曲线制作 表 1 葡萄糖标准液的吸光值 管号 葡萄糖 标准液 ml 蒸馏水 ml 葡萄糖 含量 mg OD540管号 葡萄糖 标准液 ml 蒸馏水 ml 葡萄糖 含量 mg OD540 00 01 00 000 00030 60 40 241 245 10 20 80 080 19740 80 20 321 536 20 40 60 160 72651 00 00 401 971 图 1 葡萄糖标准曲线 由于实验时间不够 这条标准曲线数据来自第一大组第二小组董晓冬组 由图可知 标准曲线的线性关系良好 可用于下面的还原糖残糖量的计算 2 1 2 样品中还原糖的含量的测定 表 2 不同发酵时间的残糖含量 发酵工程实验 论文 时间 h稀释倍数 OD540的平 均值 残糖含量 mg 时间 h稀释倍数 OD540的平 均值 残糖含量 mg 24000 39632 6144000 79265 2 42500 52026 8164000 56346 3 63000 82550 9184000 77063 4 83001 05565 1204000 84569 6 104000 77363 6224000 70457 9 124000 51042 0244000 72159 3 图 2 残糖含量随发酵时间的变化 由上图曲线可知 图中的细线是用 Excell 软件模拟的五次多项式曲线 由 R2可知曲线 拟合的结果可满足分析要求 残糖量大致有两次波动 曲线之所以没有呈现理想的逐渐变 缓的下降的趋势 可能和操作过程中温度在大约 12 小时温度上升到 42 而且花费了大 约 2 个小时的时间温度才降到正常范围 35 左右 导致大量菌体死亡 而残糖含量一直 处于上升趋势 说明谷氨酸棒杆菌的生产液中存在生成还原糖的因素 而这些解释建立在 DNS 法测定还原糖无干扰物质的前提下 2 2 谷氨酸测定 2 2 1 谷氨酸标准曲线 制作 表 3 谷氨酸标准液的吸光值 管号 谷氨酸标 准液 ml 谷氨酸含 量 mg OD569管号 谷氨酸标 准液 ml 谷氨酸含 量 mg OD569 000 00 00030 60 91 245 10 20 30 19740 81 21 536 20 40 60 726511 51 971 发酵工程实验 论文 图 3 谷氨酸标准曲线 同上 谷氨酸标准曲线源自第一大组第二小组董晓冬组 由图可知 标准曲线的线性 关系良好 可用于下面的谷氨酸含量的计算 2 2 2 样品中谷氨酸的含量 测定 表 4 不同发酵时间的谷氨酸含量 时间 hOD569的平均值谷氨酸含量 mg 140 7920 612 160 5630 434 180 7700 564 200 8450 652 220 7640 590 240 7210 556 图 4 谷氨酸含量随发酵时间的变化 发酵工程实验 论文 由谷氨酸含量曲线可知 谷氨酸的产生应该在第 14 小时之前就已经开始了 但是我们 测得的显示谷氨酸下降的曲线 说明由于谷氨酸生产液中存在消耗谷氨酸的因素 而之后 谷氨酸的含量上升说明谷氨酸棒杆菌开始正常生长 产生谷氨酸 而这些解释建立在茚三 酮法检测谷氨酸没有干扰因素的前提下 3 讨论讨论 3 1 谷氨酸合成途径及生物素 乳酸对谷氨酸发酵的影响分析 谷氨酸的生物合成途径大致是 葡萄糖经糖酵解 EMP 途径 和己糖磷酸支路 HMP 途径 生成丙酮酸 再氧化成乙酰辅酶A 乙酰 COA 然后进入三羧酸循环 生 成 酮戊二酸 酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4 存在的条件下 生成谷 氨酸 在谷氨酸发酵中 如果能够改变细胞膜的通透性 使谷氨酸不断地排到细胞外面 就会大量生成谷氨酸 研究表明 影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量 因此 对谷氨酸产生菌的选育 往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手 如生物 素缺陷型菌种的选育 生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA 的辅酶 生物素缺陷型菌种因不能合成生物素 从而抑制了不饱和脂肪酸的合成 而不饱和脂肪 酸是磷脂的组成成分之一 因此 磷脂的合成量也相应减少 这就会导致细胞膜结构不 完整 提高细胞膜对谷氨酸的通透性 当生物素缺乏时 菌种生长十分缓慢 当生物素 过量时 则转为乳酸发酵 因此 一般将生物素控制在亚适量条件下 才能得到高产量 发酵工程实验 论文 的谷氨酸 增加前体物质的合成 减弱或切断支路代谢和促进产物的分泌是提高谷氨酸产量的 思路 其中 丙酮酸是谷氨酸的前体物质 而在胞内乳酸和丙酮酸是可以相互转化的 因此添加乳酸会促进丙酮酸含虽的增加 从而增加谷氨酸的积累 1 3 2 茚三酮显色反应的影响因素分析 茚三酮与谷氨酸的显色反应灵敏度较高 但同时也受到多种因素的影响 当实验条件控 制不好时 会造成实验数据的较大偏离 从而产生较大的误差 此显色反应的影响因素主要 有以下几方面 当谷氨酸浓度在 80 140 g mL 时 颜色变化明显且显色较稳定 显色反应随 pH 的不 同颜色有明显的变化 当 pH 在 4 以下时不显色 而 pH 在 6 10 时 颜色变化明显 但因茚 三酮的水溶液在碱性条件下溶液本身带有明显的淡黄色 因此 pH 选定在 6 左右较好 此时基 本无颜色干扰且显色稳定 实验选用 90 作为最佳反应温度 一般来说 当谷氨酸浓度在 80 140 g mL 时 90 加热 20min 以上即可完全反应 时间太短 反应不完全 颜色梯度不 明显 所以最佳反应时间在 20 25min 茚三酮的丙酮溶液在 80 以上时显色较好 而茚三酮的水溶液要在 90 以上时显色才 明显 茚三酮的用量对显色反应的影响不大 当被测样品中含有其它氨基酸时也可与茚三酮发生显色反应 从而影响测定结果 但在 谷氨酸发酵中 所产的谷氨酸含量一般是其它氨基酸的几十倍 故此影响因素可忽略不计 2 但鉴于本实验中谷氨酸产率低 就不得不考虑这一影响因素了 3 3DNS 光度法测定还原糖的影响因素分析 DNS 光度法测定还原糖具有快速 简便的特点 该试验结果表明 准确定量加入 2 0ml DNS 试剂 保持显色时显色液体积一致 沸水浴显色时间不低于 2min 显色定容 30min 后于 520nm 处测定有色溶液的吸光度 是保证测定数据准确 可靠的关键 3 3 4 温度对谷氨酸发酵的影响分析 温度的控制在 38 39 之问为最佳 该温度下 转化率较高 低于 37 转化率受较大 的影响 而高于 40 的培养温度也会使菌体受到伤害 影响转化率 4 3 5 溶氧对谷氨酸发酵的影响分析 极端缺氧的条件对谷氨酸脱氢酶造成的影响是不可逆的 低溶氧对保持谷氨酸脱 氢酶的酶活性有利 但是这也造成乳酸脱氢酶的活力提高 使得代谢副产物乳酸大量积累 所以应该把溶氧控制在适当的水平 在保持谷氨酸脱氢酶较高获利的同时尽可能的降低乳 酸脱氢酶的酶活力 5 而这个最佳溶氧策略的研究还不很清楚 感谢感谢 感谢白璐老师和张新芳老师的耐心指导 感谢我们小组其他组员的共同努力与合作 并感谢董晓冬组提供的标准曲线数据 参考文献参考文献 1 王帅 et al 添加乳酸和琥珀酸对谷氨酸发酵的影响及优化研究 食品工业科技 J 2008 29 7 2 王昂 王丽丽 仪宏 赵紫华 茚三酮比色法测定谷氨酸含量的研究 中国调味品 J 2005 8 发酵工程实验 论文 3 杨贵明 蒋爱华 薛秋生 用 DNS 光度法测定还原糖的条件研究 安徽农业科学 J 2006 34 14 4 赵二红 谷氨酸发酵最佳温度实验 发酵科技通讯 J 2004 33 1 5 郜培 陆静波 段作营 毛忠贵 et al 溶氧浓度对谷氨酸发酵关键酶的影响 食 品与发酵工业 J 2005 31 10 6 白璐 发酵试验讲义 Glutamic Acid Liquid Fermentation Zeng P 1 Zhang M L 1 Zhang T X 1 Fang M 2 Zhi S P 2 Zhang H X 2 Huo Z H 2 Bao J J 2 1 Biotechnology Base Class in 2008 2 Biotechnology Class in 2008 Abstract Objective To learn the glutamic acid Liquid Fermentation in Fermentation tank in laboratory Methods To determinate the concentration of reducing suger and glutamic acid in the fermentation process with spectrophotometer Results We fai