药物分析答案培训

1 1 样品前处理目的 样品前处理方法都有哪些 常用 样品前处理目的 样品前处理方法都有哪些 常用 C18C18 固相萃取法原理 洗脱步骤 注固相萃取法原理 洗脱步骤 注 意事项意事项 1 1 样品前处理目的 样品前处理目的 1 浓缩痕量的被测组分 提高方法的灵敏度 降低检测限 2 去除样本中的基体与其他干扰物质 3 通过衍生化 使被测物转化成为检测灵敏度更 高的物质或转化为与样本中干扰组分能够分离的物质 提高方法的灵敏度和选择性 4 保护下游分析仪器以及测试系统 避免影响整机性能及寿命 2 2 样品前处理方法 样品前处理方法 沉淀 液 液萃取 固相提取 渗析 超滤 电泳 蒸馏 蒸发 3 3 常用 常用 C18C18 固相萃取法原理 固相萃取法原理 固相提取 利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附 与样品的基体和干扰化合物分离 然后再用洗脱液洗脱 达到分离和和富集的目的 利 用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小差异实现净化分离 4 4 洗脱步骤 洗脱步骤 1 活化 依次用强溶剂 弱溶剂 缓冲溶液 进行活化 2 上样 用能够溶解样品的弱溶剂携带样品上柱 既要保证样品分析物的有效溶解 又要确保溶剂强度不至于把被分析化合物从柱上洗脱下来 3 淋洗 用具有一定强度的混合溶剂淋洗去除干扰杂质 确保杂质被洗脱 而被分析 化合物有效的保留在柱上 4 洗脱 用较强的溶剂把被分析化合物从柱上替换洗脱下来 5 5 注意事项 注意事项 1 根据分析目标物的理化性质选择合适的 SPE 柱 2 一般 SPE 柱要防止干涸 3 注意控制柱载量 防止穿透过载 4 严格控制上样液和洗脱液滴速 5 防止混浊样品堵塞柱子 2 2 以高效液相色谱法测定某类药物含量为例 试述分析方法验证的内容 以高效液相色谱法测定某类药物含量为例 试述分析方法验证的内容 查阅文献 查阅文献 系统适应性 1 准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度 用百分回收率表示 2 精密度 是指在规定条件下 同一个均匀样品 经多次取样测定所得结果之间的接近程 度 用偏差 d 标准偏差 SD 相对标准偏差 RSD 变异系数 CV 表示 A 重复性 在相同条件下 由同一个分析人员测定所得结果的精密度 B 中间精密度 同一实验室 不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度 C 重现性 不同实验室 不同分析人员测定结果的精密度 3 专属性 指有其他成分 杂质 降解物 辅料等 可能存在情况下采用的方法能准确测 定出被测物的特性 能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力 是 指 该法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量 4 检测限 试样中被测物能被检测出的最低量 常用 ppm ppb 表示 5 定量限 是一种含量测定的定量参数 指样品中被测物能被定量测定的最低量 结果应 具有一定准确度和精密度 常用 ppm ppb 表示 6 标准曲线 在设计的范围内 测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度 7 线性范围 指达到一定精密度 准确度和线性的条件下 测试方法适用的高低限浓度或 量的区间 8 耐用性 指测定条件稍有变动时 结果不受影响的承受程度 为常规检验提供依据 是 衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度 3 3 简述高效色谱原理 从速率理论方程出发试述影响分离的因素 简述高效色谱原理 从速率理论方程出发试述影响分离的因素 1 1 高效色谱原理高效色谱原理 当流动相中携带的混合物流经固定相时 其与固定相发生相互作用 由 于混合物中各组分在性质和结构上的差异 与固定相之间产生的作用力的大小 强弱不同 随着流动相的移动 混合物在两相间经过反复多次的分配平衡 使得各组分被固定相保留 的时间不同 从而按一定次序由固定相中流出 与适当的柱后检测方法结合 实现混合物 中各组分的分离与检测 2 2 从速率理论方程出发试述影响分离的因素从速率理论方程出发试述影响分离的因素 速率方程 也称范 弟姆特方程式 H A B u C u H 理论塔板高度 u 载气的线速度 cm s 1 A 2 dp dp 固定相的平均颗粒直径 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp 填充的越均匀 A H 柱效n 表现在涡流扩散所引起的色 谱峰变宽现象减轻 色谱峰较窄 2 B 2 Dg 弯曲因子 填充柱色谱 1 Dg 试样组分分子在气相中的扩散系数 cm2 s 1 1 存在着浓度差 产生纵向扩散 2 扩散导致色谱峰变宽 H n 分离变差 3 分子扩散项与流速有关 流速 滞留时间 扩散 4 扩散系数 Dg M载气 1 2 M载气 B值 3 C u 传质阻力项 传质阻力包括气相传质阻力Cg 和液相传质阻力CL 即 C Cg CL g f g D d k k C 2 2 1 01 0 L f L D d k k C 2 2 1 3 2 k为容量因子 Dg DL 为扩散系数 减小担体粒度 选择小分子量的气体作载气 可降低传质阻力 4 4 简述色谱系统适用性试验 简述色谱系统适用性试验 答案答案 1 1 定义 该实验是把分析设备 电子仪器 实验操作和被 分析样品作为一个整体 来进行评估 系统适应性参数是根据被验证的方法类型 对某一特定方法而建立的 比如 有关物质着 重考虑某两个相邻的峰分离度 拖尾因子 面积 RSD 理论塔板数 含量分析方法考虑面 积 RSD 拖尾因子 理论塔板数等 PPT 答案答案 2 2 色谱系统的适用性试验通常包括理论板数 分离度 重复性和拖尾因子等四个指 标 其中 分离度和重复性是系统适用性试验中更重大的参数 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验 即用规定的对照品溶液或系统适用性试验 溶液对色谱系统进行试验 必要时 可对色谱系统进行适当调整 应适合要求 1 色谱柱的理论板数 n 用于评价色谱柱的效用 在规定的色谱条件下 注入供试品 溶液或各品种项下规定的内标物质溶液 记录色谱图 量出供试品主成分峰或内标物质峰 的保留时间 tR 以分钟或长度计 下同 但应取相同单位 和峰宽 W 或半高峰宽 Wh 2 按 n 16 tR W 2 或 n 5 54 tR Wh 2 2 计算色谱柱的理论板数 2 分离度 R 用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离水平 是衡量 色谱系统效用的主要指标 除另有规定外 待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于 1 5 或通过验证 待测组分与指标性成分之间的分离度应大于某一规定值 分离度的计算 公式为 R 2 tR2 tR1 W1 W2 或 R 2 tR2 tR1 1 70 W1 h 2 W2 h 2 式中 tR2 为相邻两峰中后一峰的保留时间 tR1 为相邻两峰中前一峰的保留时间 W1 及 W2 为此相邻两峰的峰宽 如图 当对测定结果有歧义时 色谱柱的理论塔板数 n 和分离度 R 均以峰宽 W 的计算结 果为准 3 重复性 用于评价连续进样后 色谱系统响应值的重复性能 采用外标法时 通常取 各品种项下的对照品溶液 连续进样 5 次 除另有规定外 其峰面积测量值的相对尺度错 误应不大于 2 0 采用内标法时 通常配制相当于 80 100 和 120 的对照品溶液 加入 规定量的内标溶液 配成 3 种不同浓度的溶液 离别至少进样 2 次 计算平均校正因子 其相对尺度错误应不大于 2 0 4 拖尾因子 T 用于评价色谱峰的对称性 为保障分离效果和测量精度 应检验待测 峰的拖尾因子是否适合各品种项下的规定 拖尾因子计算公式为 T W0 05h 2d1 式中 W0 05h 为 5 峰高处的峰宽 d1 为峰顶点至峰前沿之间的距离 除另有规定外 峰 高法定量时 T 应在 0 95 1 05 之间 峰面积法测定时 若拖尾严重 将影响峰面积的准 确测量 必要时 可依据情况对拖尾因子作出规定 5 5 简述液质联用中离子化方式 其原理 特点 简述液质联用中离子化方式 其原理 特点 答 液质联用中离子化方式分为电喷雾电离 ESI 和大气压化学电离 APCI 电喷雾电离 ESI 原理 在带电小液滴溶剂蒸发 产生离子发射的过程中形成的 溶 剂由液相泵输送到 ESI Probe 经其内的不锈钢毛细管 从毛细管的顶端流出 这时毛细 管被加了 2 4kv 的高压 由于高压和雾化气的作用 流动相从毛细管顶端流出时 会形成 扇状喷雾 含样品和溶剂离子的小液滴 电喷雾电离 ESI 特点 优点 分子量确认 适合于挥发及不挥发的溶质 适合于离子化及极性的溶质 好的灵敏度 高分子量测定 适合于毛细管色谱 缺点 相对较低的 LC 流速 在溶液中必须离子化 在高盐条件下会发生离子抑制 产生加和离子影响结果 有限的结构信息 大气压化学电离 APCI 原理 在大气压条件下利用尖端高压 电晕 放电促使溶 剂和其他反应物电离 碰撞 及电荷转移等方式 形成一个反应气等离子区 样品分子通 过等离子区时 发生质子转移 形成了 M H 或 M H 离子或加和离子 大气压化学电离 APCI 特点 优点 利用所得到 M 1 及 M 1 进行分子量确认 源参数调整简单 容易使用 耐受性好 喷雾器及针的位置不关键 LC 流速可达 2 0ml min 好的灵敏度 缺点 有限的结构信息 易发生热裂解 低质量时化学噪声大 不适合做分子量大于 1000 的化合物 大多数的接口需要挥发性缓冲液 6 6 离子色谱法原理 检测器种类 其关键部件抑制器与淋洗液发生器的作用 简述脉冲安 离子色谱法原理 检测器种类 其关键部件抑制器与淋洗液发生器的作用 简述脉冲安 培检测器测定糖类或氨基酸的原理 培检测器测定糖类或氨基酸的原理 1 1 离子色谱法原理 离子色谱法原理 离子色谱的分离机理主要是离子交换 有 3 种分离方式 它们是高效 离子交换色谱 HPIC 离子排斥色谱 HPIEC 和离子对色谱 MPIC 用于 3 种分离方式的 柱填料的树脂骨架基本都是苯乙烯 二乙烯基苯的共聚物 但树脂的离子交换功能基和 容量各不相同 HPIC 用低容量的离子交换树脂 HPIEC 用高容量的树脂 MPIC 用不 含离子交换基团的多孔树脂 3 种分离方式各基于不同分离机理 HPIC 的分离机理主 要是离子交换 HPIEC 主要为离子排斥 而 MPIC 则是主要基于吸附和离子对的形成 2 2 离子色谱法检测器种类离子色谱法检测器种类 电导检测器 安培检测器 紫外 可见检测器 荧光检测器 电子捕获质谱检测器 3 3 抑制器的作用与淋洗液发生器的作用 抑制器的作用与淋洗液发生器的作用 A 降低背景噪声 B 提高检测灵敏度 4 4 脉冲安培检测器测定糖类或氨基酸的原理 脉冲安培检测器测定糖类或氨基酸的原理 用安培法检测氨基酸 通常采用金工作电极 Ag AgCl 或玻璃 Ag AgCl 参比电极和钛对电极 在 pH 12 13 溶液中 在金工作电极和 Ag AgCl 参比电极之间施加一个较高的电位 氨基酸在金电极表 面被氧化 大多数氨基酸开始先被氧化为亚胺 1 然后进一步氧化为腈基化合物 2 另外 少量的亚胺发生水解生成醛类化合物 3 反应过程如下 1 R CH NH2 COO R CH NH CO2 H 2e 2 R CH NH R CN 2H 2e 3 R CH NH H2O R CHO NH3 7 简述气相色谱法 常用检测器 种类和特点及其在药品溶剂残留测定中的应用 1 1 常用检测器常用检测器 热导检测器 氢火焰离子化检测器 电子捕获检测器 火焰光度检测器 热导检测器 氢火焰离子化检测器 电子捕获检测器 火焰光度检测器 氮磷检测器 氮磷检测器 2 2 种类 种类 根据检测器的响应原理 可将其分为浓度型和质量型检测器 浓度型 检测的是载气中组分浓度的瞬间变化 即响应值与浓度成正比 如 TCD ECD 质量型 检测的是载气中组分进入检测器中速度变化 即响应值与单位时间进入检测器的 质量成正比 如 FID FPD 根据应用范围 分为通用型检测器和选择型检测器 通用型 对所有物质有响应 如 TCD FID 选择型 对特定物质有高灵敏响应 如 ECD FPD NPD 根据工作过程 分为破坏型检测器和非破坏型检测器 破坏型 检测过程中样品遭到破坏 不能回收 如 FID FPD 非破坏型 检测过程中样品不遭到破坏 可以回收 如 TCD ECD 3 3 特点及其应用 特点及其应用 符号 TCDFIDECDFPDNPDMSD 检测方法物理常数 法 气相电离 法 气相电离 法 光度法气相电离法质谱法 工作原理热导率差 异 火焰电离化学电离分子发射热表面电离电离与质 量色散结 合 类型浓度型 通用型 非破坏性 质量型 准通用型 破坏性 质量型 选择型 非破坏性 浓度型 选择型 破坏性 质量型 选择型 破坏性 质量选择 型 灵敏度 2500 mv ml mg 10 11g s 10 13g s 硫 10 10g s 磷 10 11g s 氮 5 10 11g s 磷 2 10 12g s 线形范围 104 106 102 104 硫 102 磷 103 104 105 105 应用范围所有化合 物 有机化合 物 电负性化 合物 硫 磷 化合物 氮 磷化合物 农药残留 所有化合 物 结构检 定 应用 1 在职业病和法庭分析中 经常要测定体液等中的苯 甲苯 二甲苯等有毒成分 采用顶空分析是一种有效 方便 快速的方法 司法部司法鉴定科学技术学院制订了分析 水 尿 血中苯类化合物的静态顶空分析方法 方法 5mL 青霉素小瓶 取 1mL 试样 水 尿 血 加入 0 4 内标物和约 1g 硫酸铵至 饱和 加盖密封 置于 80 C 的恒温器中 30min 取 0 6mL 顶空的气样色谱分析 色谱柱 2m 2mm 80 100 目 固定液 PEG 20M 柱温 110 C 以 10 C min 程序升温到 110 C 应用 2 分析血样中的酒精是顶空气相色谱应用最广泛的方法 可检查汽车司机是否酒后 驾车 方法 样品平衡温度 50 C 平衡时间 30min 色谱柱 30m 0 53mm 石英毛细管柱 固定液 聚二甲苯硅氧烷 8 原子发射光谱的原理 及其在中药产品中重金属分析方面的优缺点 文献 1