透明质酸的制备

透明质酸的生产工艺 透明质酸 HA 的生产工艺主要分为二大类 以动物组织 为原料的提取法和细菌发酵法 透明质酸在动物组织中的分布 较为广泛 几乎所有的动物组织中均含有透明质酸 只是含量 不同 已从下列组织中分离出了透明质酸 结缔组织 脐带 皮肤 人血清 鸡冠 关节滑液 脑 软骨 眼玻璃体 人尿 鸡胚 兔卵细胞 动脉和静脉等 但考虑到原料透明质酸含量 的高低 数量的多少和易于取得的程度等成本因素 能够用于 生产的原料主要为鸡冠 人脐带和动物眼球 细菌发酵法是利 用某些种属的链球菌 在生长繁殖过程中 向胞外分泌以透明 质酸为主要成分的荚膜 细菌发酵法与动物组织提法相比 具 有生产规模不受动物原料限制 发酵液中透明质酸以游离状态 存在 易于分离纯化 成本低 易于形成规模化工业生产 无 动物来源的致病病毒污染的危险等优点 透明质酸无种属差异 不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸 在化学 本质和分子结构上是一致的 只是相对分子质量 r 有差 别 1 以雄鸡冠 roostercomb 为原料的生产工艺 一 工艺路线 二 工艺流程 1 提取冻鸡冠解冻后 用绞肉机绞碎 加适量水用胶体磨磨 成糊状 按每 1kg 鸡冠加水 8L 加氯化钠 80g 搅拌加热至 90 保温 10min 冷却至 50 用 1mol L 氢氧化钠液调 pH8 5 9 0 加入适量胰酶 45 50 保温酶解 5 7h 酶解过程中 维持 pH8 5 9 0 2 过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤 得澄清滤液 3 乙醇沉淀和粗品干燥取滤液 调 pH6 0 6 5 将滤液加到 3 倍体 积的 95 乙醇中 反复倾倒 3 次 待纤维状沉淀充分上浮后 取出 沉淀 用适量乙醇脱水 3 5 次 放入有五氧化二磷的真空干燥器 内干燥 得透明质酸中间品 4 氯仿处理将透明质酸中间品溶于 0 1mol L 氯化钠溶液中 溶 解浓度为 0 3 溶解过程中加少量氯仿防腐 溶解后 调 pH4 5 5 0 加入等体积的氯仿搅拌处理 2 次 静置分出水相 5 酶解将水相用稀氢氧化钠溶液调 pH7 5 加入适量链霉蛋白 酶 37 酶解 24h 6 络合沉淀酶解结束后 向酶解液中加入同体积的 1 氯化 十六烷基吡啶 CPC 溶液 静置 收集 HA CPC 络合沉淀 7 解离将 HA CPC 络合沉淀加入 0 4mol L 氯化钠溶液中 搅 拌解离 5 10h 8 过滤解离液先用硅藻土过滤至清 再用 0 2 m 微孔滤膜精 滤 9 纯沉淀 真空干燥将滤液加至 3 倍体积的 95 乙醇中 反 复倾倒 3 次 取出纤维状 HA 沉淀 脱水 五氧化二磷真空干 燥 得 HA 精品 三 工艺说明与讨论 1 对原料的预处理 鸡冠应洗净后冷冻储藏 也可用丙酮脱 水处理或储存 这样可除去大部分脂肪等杂质 以利于后面的 分离纯化 但成本加大 2 鸡冠绞碎后用胶体磨处理时 注意不要磨得太细 以减少 机械剪切力对透明质酸的降解 磨成糊状后 可先用水提取 过滤除去鸡冠残渣得提取液 然后进行酶解除蛋白质 也可将 水提取和蛋白酶水解同时进行 后者的提取效率高 几乎达到 完全提取 但提取液中的杂质含量也较高 提取时 可在水中 加入 1 的氯化钠 加热至 90 可对原料有一定灭菌作用 并 使蛋白质热变性 易被蛋白酶水解 所用的蛋白水解酶为胰酶 木瓜蛋白酶 链霉蛋白酶 中性蛋白酶 碱性蛋白酶等 不可 用胃蛋白酶 因胃蛋白酶的最适 pH 值太低 易导致透明质酸 的酸水解 公鸡冠中的透明质酸以与蛋白质结合状态存在 酶 解的另一重要作用是切断透明质酸与蛋白质分子的结合 提取 和酶解时 应注意防腐 3 透明质酸的提取液粘度较大 过滤速度较慢 可采用先粗 滤后精滤 并加纸浆 硅藻土或活性炭助滤 4 醇沉淀是分离提纯透明质酸 肝素 硫酸软骨素等粘多糖 最常用的方法之一 在制备过程中 可多次重复使用 类似于 重结晶的作用 每次醇沉淀操作 都使透明质酸的纯度有所提 高 不同最终浓度的乙醇沉淀操作还可对不同 r 的透明质酸 进行分级分离 在较低乙醇浓度下 低 r 的透明质酸不易被 沉淀出来 r 越高 越容易被沉淀 在从水溶液中用甲醇或 乙醇沉淀透明质酸或其它粘多糖时 必须有盐的存在 一般为 1 左右的氯化钠 沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形 态 纤维状透明质酸容易制备 形态疏松 易于脱水和真空干燥 缺 点是使用时 溶解速度慢 若在常温下溶解成 1 的水溶液 需要 3 7d 制备无定型粉末状沉淀 需控制料液的盐浓度 料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素 工艺较复杂 但粉末状透明质酸溶解速度快 使用方便 5 第一次乙醇沉淀 脱水 真空干燥所得透明质酸产品 可 作为化妆品用保湿剂 6 上述产品透明质酸进行进一步精制时 可以使用干燥的 产品 也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品 这样可以缩短生产 周期 7 氯仿可使蛋白变性沉淀 利用此作用可除去一部分蛋白质 杂质 氯仿处理的另一个重要的作用 是除去致炎物质 如细 菌内毒素是一种脂多糖 lipopolysaccharide 其分子兼具脂 溶性和水溶性 在进行氯仿处理时 聚集在氯仿和水的界面 利用这一性质可除去细菌内毒素 另外 加快搅拌速度 可提 高氯仿在水中的分散度 极大地扩大氯仿和水的界面面积 提 高去除细菌内毒素等致炎物质的效率 可反复多次进行氯仿处 理 8 在精制过程中 再一次使用蛋白水解酶进行酶解除蛋白 质时 应选用活性较高的酶 因为酶本身是一种蛋白质 在保 证酶的总活性单位的前提下 酶的总重量越少越好 这样可减 少产品中的蛋白质杂质 9 CPC 络合沉淀与解离步骤是分离提纯酸性粘多糖 透明质 酸 肝素 硫酸软骨素 硫酸皮肤素等 常用的方法之一 特 点是纯化效率高 回收率高 可以从很低浓度的溶液中将透明 质酸或其它酸性粘多糖沉淀出来 原理是 CPC 为季铵盐 在水溶液中带正电荷 透明质酸或其它酸性粘多糖 在水溶液 中带负电荷 在低盐浓度下 透明质酸与 CPC 络合沉淀 在 高盐浓度下 HA CPC 络合物解离溶解 利用这一性质 可除 去不能与 CPC 络合并沉淀的杂质 透明质酸与其它酸性粘多 糖聚阴离子的电荷密度不同 与 CPC 络合生成沉淀时盐浓度 可以不同 络合沉淀物解离所需的最低盐浓度也不同 使用 CPC 络合沉淀法 可实现透明质酸与肝素 硫酸软骨素等酸 性粘多糖的分离 此原理与离子交换法有类似之处 除 CPC 外 也可使用溴化十六烷基吡啶 CPB 十六烷基三甲 基溴化铵 CTAB 等其它长链季铵盐 10 透明质酸在干燥之前要充分脱水 否则有机溶剂挥发后 残存的水分过多 会导致被干燥的产品粘结 不易于干燥 干 燥时间延长 干燥后产品变硬 变黄 脱水所用的溶剂为 95 乙 醇 无水乙醇 丙酮和甲醇 丙酮的沸点低 挥发性高 用丙 酮脱水易于干燥 但干燥后的产品带有特殊气味 干燥的产品 量较少时 可采用静止状态下 加五氧化二磷进行常温真空干 燥 产品量较多时 可采用动态的真空干燥 温度控制在 50 65 不用五氧化二磷 2 以人脐带 humanumbilicalcord 为原料的生产工艺 一 工艺路线 二 工艺过程 1 提取丙酮脱水脐带在提取前应通风挥发干丙酮 剪碎 加 入蒸馏水中浸泡 24h 用高速组织捣碎机打成细小碎块 用蒸 馏水反复提取 4 次 第一次加水量为脱水脐带 10 倍 之后三 次适量递减 合并提取液过滤得滤液 2 氯仿处理滤液中加入 10 量的氯化钠 搅拌使溶解 用稀 盐酸调 pH5 0 加入等体积的氯仿搅拌处理 静置 待分层后分 出水相 同样再加氯仿处理一次 分出水相 3 酶解用稀氢氧化钠调 pH7 5 按水相体积加入 0 4 量的链 霉蛋白酶 置 37 保温酶解 24h 4 氯仿处理再用氯仿处理 2 3 次 分出水相 5 乙醇沉淀加入 3 倍体积的 95 乙醇沉淀出透明质酸 取出 沉淀 重新溶解于 0 1mol L 的氯化钠溶液中 再次用 3 倍体积 95 乙醇沉淀 6 脱水干燥分别用 95 乙醇 丙酮脱水 五氧化二磷真空干 燥得透明质酸精品 三 工艺说明与讨论 1 对原料预处理 新生儿脐带剪下后 应尽量挤出里面血管 中存留的血液 再放入丙酮中脱水保存 若在提取前发现脱水 脐带血管中残存较多血凝快 应将血管剥离 以减少提取和纯 化过程中的血色素污染 否则 产品带有颜色 2 本工艺尽量采用温和条件 避免可能使透明质酸大分子降 解的处理 如加热 强酸 强碱等 3 实验发现 在高盐浓度下 有机溶剂可使大部分蛋白质变 性 或被盐析沉淀出 或在乙醇沉淀后不再溶于水 这样可使 提取液得到明显的纯化 4 本工艺未使用氯化十六烷基吡啶 CPC 络合沉淀法进行 纯化 所得产品纯度较低 可能混有其它多糖 蛋白质杂质含 量也较高 0 6 0 8 但由于所用的原料为人脐带 所得透 明质酸精品作为眼科手术用粘弹辅助剂时 引起抗原反应的可 能性较小 三 以动物眼玻璃体为原料的制备工艺 一 工艺路线 二 工艺过程 1 提取将冷冻的牛 猪或羊眼球解冻 剥出玻璃体 融化后 离心 分出上清 加入 1 5 倍体积的丙酮沉淀 8h 后离心 所 得沉淀加入到 1mol L 氯化钠溶液中 搅拌提取 4h 离心 2 除蛋白质上清液在低温下加入冷的 5 三氯乙酸 搅匀 立即离心分出上清液 用 5mol L 氢氧化钠溶液调 pH 值至中 性 3 粗品沉淀将中性上清液倒入 2 倍体积 95 乙醇中 分出 沉淀 4 溶解 吸附除杂质将沉淀溶于 0 1mol L 氯化钠溶液中 加 入处理好的漂白土搅拌吸附 2h 离心收集上清液 5 络合沉淀向上清夜内加入等体积的 1 CPB 溶液 得 HA CPB 沉淀 放置 12h 后离心 收集沉淀 6 解离沉淀洗涤后于 0 4mol L 氯化钠溶液中解离 4h 抽滤 7 沉淀 干燥 将滤液倒入 3 倍体积 95 乙醇中 分出沉淀 沉淀经乙醇 丙酮脱水 放于有五氧化二磷的真空干燥器内干 燥 得玻璃酸钠精品 三 工艺说明与讨论 1 以动物眼玻璃体为原料制得的透明质酸 其质量较以雄鸡 冠和人脐带为原料者差 相对分子质量 Mr 较小 一般不适于 作注射剂使用 2 吸附除杂质步骤 尚可选用类似吸附剂 天然矿物质吸附 剂常因生产厂或同一厂批次不同在吸附性能上有差异 其预处 理方法也很重要 要根据实际情况实验研究来确定具体操作方 法 3 CPB 与 CPC 的性能基本相同 两者在透明质酸的 生产中可相互代用 四 细菌发酵法生产工艺 一 工艺路线 二 工艺过程 1 摇瓶种子液的培养取斜面菌种 接种于装有灭菌培养液 400ml 的 1L 锥形瓶中 37 培养 12 16h 光镜观察菌体生长 良好 无杂菌污染 即可接种于种子罐中 培养液配方 蛋白 胨 10g 牛肉浸膏 5g 酵母膏 5g 葡萄糖 5g 磷酸氢二钾 2g 硫酸镁 0 3g 加水溶解至 1L 115 灭菌 30min 2 种子罐种子液的培养按摇瓶种子液的配方配制培养液 100L 加入种子罐中 通蒸汽加热 115 灭菌 30min 冷却 至 37 用火焰接种法 将摇瓶种子液接种于种子罐中 通 气量 50L min 搅拌 120rpm 37 培养 12 16h 光镜观察菌 体生长良好 无杂菌污染 即可待接种于发酵罐中 3 发酵按摇瓶种子液配方 将葡萄糖含量提高到 5 配制 发酵培养液 1000L 加入 1 4m3 发酵罐中 通入蒸汽加热 115 灭菌 30min 冷却至 37 后 将种子罐中的种子液通过移种 管道移至发酵罐中 维持通气量 500 600L min 搅拌转速 120rpm 37 发酵 40 46h 在发酵过程中 发酵液的 pH 值 不断下降 加 5mol L 氢氧化钠溶液 调 pH6 5 7 0 发酵后期 葡萄糖浓度下降至 0 5 以下 pH 值下降很慢或不再下降时 即 为发酵终点 4 下游分离纯化发酵结束 用三氯乙酸调 pH4 0 4 5 板框过滤 除菌体 滤液用稀氢氧化钠调 pH6 0 6 5 加三倍体积 95 乙醇 沉淀出透明质酸 沉淀用发酵体积的 0 1mol L 氯化钠水溶液 溶解 加入 0 5 的活性炭 搅拌吸附 1h 过滤 滤液在搅拌 下 加入过量的 1 CPC 水溶液与滤液中的透明质酸发生络合沉 淀 静置使沉淀下沉 虹吸出母液 加入 0 1mol L 氯化钠液洗涤沉 淀两次 沉淀于发酵体积的 0 4mol L 氯化钠液中搅拌解离过 夜 过滤 滤液加三倍体积乙醇沉淀 沉淀用乙醇和丙酮脱水 用旋 转式真空干燥器进行干燥 得透明质酸钠 三 工艺说明与讨论 1 早在 1937 年 Kendall 等 12 就发现链球菌可产生透明质酸 许多人对此进行了研究 链球菌属的多种细菌具有荚膜 见图 3 1 和图 3 2 这种荚膜的主要成分就是透明质酸 链球菌在 生长过程中 荚膜的产生有几种不同的情况 有的菌株在整个 生长期都有荚膜 有的在对数生长期的前段产生 后段消失 或稳定期消失 有的根本不产生荚膜 进一步的研究发现这与 菌种是否产生透明质酸酶有密切关系 事实上目前一部分商品 透明质酸酶就是用链球菌发酵制得的 荚膜的消失是由于被酶 解了 MacLennan 13 根据是否产生透明质酸和透明质酸酶 将具有荚膜的链球菌 C 组分为三类 1