高中生物《细胞分化、衰老和凋亡》素材4 苏教版必修1

用心 爱心 专心 1 第第 2 2 节节 细胞分化 衰老和凋亡细胞分化 衰老和凋亡 细胞凋亡 细胞凋亡 apoptosisapoptosis 细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下 受内在遗传机制的控制自动结束生命的 过程 而细胞程序性死亡 programmed cell death PCD 是指生物在发育过程中对一定生 理刺激的反应性死亡 它需要一定基因表达 凋亡是对细胞死亡过程中一系列固定模式的形 态变化的描述 而 PCD 则是侧重功能上的概念 两者有差异 但常混为一谈 细胞凋亡 ap Ptosis 或程序化细胞死亡 programmed cell death PCD 是多细胞有 机体为调控机体发育 维护内环境稳定 Pb 基因控制的细胞主动死亡过程 目前 细胞自发 退化死亡现象有种种命名 较为常用的是程序化细胞死亡 Programmed cell death PCD 最初用于胚胎发育方面 胚胎分化过程中特定部位的细胞自发退化死亡是由于该部位的细胞 内基因按一定程序表达的结果 又称基因指令性细胞死亡 生理性细胞死 自然发生细胞死 亡 细胞舍生 凋亡或细胞凋亡等 援引 细胞凋亡基础与临床 人民军医出版社 该名词在 20 世纪 70 年代被首次提出 指的是在生理或某些病理条件下由基因控制的一 种单个细胞温和死亡形式 多细胞生物在发生 发展过程中 为了保持正常的生理机能 一 部分的细胞发生自发性细胞死亡 这种细胞死亡是被细胞内一系列相关的分子所调控 并伴 随有典型的形态学改变 这种现象被称为细胞凋亡 作为一种积极排除生物体内的过剩细胞 和有害细胞的机制在个体形态形成 形态改变等发生过程中 成体的恒常性的维持以及生物 体的防御等方面发挥作用 此外在许多病理状态下也存在着细胞凋亡 有的学者认为 细胞 程序死亡受基因的控制 E M Hedgecock 等人 1983 曾对隐杆秀丽线虫在胚胎发生中的细胞死 亡现象做过详细观察 这种动物在发生中基本上按一种形式进行细胞分裂 在所产生的细胞 中 有的即在一定时间死亡 例如 在两性动物胚胎发生中所产生的 671 个细胞 就有 118 个在孵化前死亡 死亡的细胞被临近的细胞所吞噬分解 当有两个基因 ced 1 和 ced 2 发生突变时 便失去了吞噬能力 但在这些突变体中 细胞仍按正常的时间死亡 这说明 细胞的死亡是因细胞 自杀 而发生程序死亡的结果 Ellis 等人 1982 还发现了与红细胞 死亡有关的另一个基因 ced 3 ced 3 突变即可阻止细胞开始死亡而且这些细胞还发生 了分化进一步支持了程序死亡的观点 细胞凋亡是生物界广泛存在的一种基本生命现象 如 同细胞生长 发育 增殖一样 起着十分重要的作用 目前认为 诱导凋亡的细胞外刺激必 须通过细胞内一系列信号传递 造成 选择性的在核小体之间断裂是其重要标志之一 细胞凋亡是以细胞核浓缩 染色体 DNA 被以核小体为单位切成梯状片段 ladder 细 胞缩小 最终形成细胞凋亡小体等形态变化为特征 不引起周围细胞的溶解 细胞凋亡是在 细胞群中散发 阶段性进行 并且依存于 的供给和 蛋白质的合成 是主动排 除机制 不仅在个体发育时和卵细胞退缩等生理状态下可观察到 而且在自身免疫性疾病 用心 爱心 专心 2 神经变质性疾病 缺血性疾病等很多疾病及病理状态下也可观察到 细胞凋亡的细胞内信息 传导途径可大致分为二个阶段 即诱导阶段和实行阶段 细胞凋亡的诱导阶段诱导细胞凋亡的因素有内源性的和外源性的因素 内源性的因素包 括细胞凋亡诱发机制 如 as 配体 肿瘤坏死因子等 的激活和抑制机制 生长因子 激素 受体因子等增殖性因子 的失活 外源性的因素包括放射线 热休克等物理性因素 药物 毒物等化学性因素以及病毒 04 细菌等生物学因素 近年来还发现活性氧以及一氧化氮在神 经系统疾病 心血管疾病 免疫性疾病及老化等方面的作用都不同程度地与细胞凋亡有关 近来研究表明 细胞凋亡发生的关键环节不在细胞核 而在细胞质 在凋亡细胞被诱导 产生特征性形态改变和 DNA 降解之前 线粒体膜功能发生改变 内膜跨膜电位消失和线粒体 内蛋白酶活化物的释放 激发各种凋亡相关的代谢变化 细胞凋亡的生物学功能 1 清除无用的或多余的细胞 人脑在发育过程中有 95 的细胞死亡 2 除去不再起作用的细胞 如蝌蚪变态时的尾部细胞死亡 哺乳动物子宫内膜上皮 细胞在月经期死亡 3 除去发育不正常的细胞 如脊椎动物视觉系统的发育 没有形成正确神经元连接 的神经元被清除掉 4 除去一些有害细胞 胸腺细胞在离开胸腺之前被诱导死亡 细胞凋亡的过程 细胞凋亡的过程大致可分为四个阶段 1 凋亡信号转导 当细胞内外的凋亡诱导因素与被作用的细胞受体结合后 细胞产生复杂的生化反应 并 形成与凋亡有关的第二信使 cAMP Ca2 神经酰胺等信号分子形成死亡信号 2 凋亡基因激活 调控的凋亡基因在接受死亡信号后 开始按预定程序启动 并合成执行凋亡所需的各种 酶和相关物质 3 凋亡的执行 共同通路 凋亡的主要执行者有两类酶 核酸内切酶 endogenous nuclease Dnase 彻底破 坏细胞的生物命令系统 Caspases 3 细胞的结构全面解体 4 凋亡细胞的清除 凋亡后细胞可以被邻近巨噬细胞分解 凋亡时细胞的主要变化 凋亡作为一种生理性 主动的细胞死亡 它的死亡过程和形态变化与细胞坏死有显著的 差别 1 形态学改变 用心 爱心 专心 3 实体细胞凋亡时 其表面微绒毛消失 与周围细胞脱接触 凋亡细胞胞浆开始脱水产生空泡 并与胞膜融合 出现胞膜空泡化 blebbing 因水份丧失出现细胞固缩 condensation 核固缩和发芽 在细胞凋亡末期 碎裂的核物质由一薄层胞浆包被 形成所谓的凋亡小体 apoptotic body 在凋亡的整个过程中 没有细胞的内容物的外漏 因此也不伴有局部的炎症反应 2 生化改变 DNA 的片段化 由于核酸内切酶激活 基因组的 DNA 在核小体连接区发生非随机性降解 产生寡核小 体片段 其大小相当于核小体 160 200bp 的倍数 在琼脂糖凝胶电泳中可见特征性 的 梯 状 ladder pattern 条带 钙超载 在 80 年代人们发现用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现凋亡的细胞内游离 Ca2 浓 度显著上升 用 Ca2 载体 A23187 人为提高 B 淋巴细胞内 Ca2 的水平 可诱导 B 淋 巴细胞的凋亡 而用钙络合剂降低细胞内水平 能阻止凋亡发生 后发现凋亡细胞存在钙超 载现象 Ca2 在细胞凋亡中充当凋亡信号传递的角色 内源性核酸内切酶激活 在凋亡时 细胞核内的核酸内切酶常常被激活 从无活性状态变成有活性 多数核酸内 切酶是一种二价金属离子依赖性酶 Ca2 Mg2 可增加酶的活性 而 Zn2 能抑制它的活 性 当然在某些细胞内也存在非二价金属离子依赖性核酸内切酶 Zn2 也不能抑制其活性 除了上述外 还有可出现细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻 由细胞膜内侧转向膜外侧 caspase 激活 蛋白激酶 C PKC 活化等 细胞凋亡又称细胞编程性死亡 PCD 细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束 生命的过程 又称为细胞编程性死亡 有人以秀丽隐杆线虫为材料 观察发现该线虫个体发 育中 共产生 1090 个体细胞 其中 131 个细胞在发育过程中必定死亡 蝌蚪变态时 尾部 细胞退化也是一种编程性死亡 研究表明 尾部退化是受甲状腺素控制的 当蝌蚪发育到一 定时期 甲状腺素分泌就会增加 发出编程性死亡信号 随后细胞开始凋亡 形成凋亡小体 这些凋亡小体被周围的巨噬细胞吞噬清除 2 细胞凋亡的生物学意义 近年来大量的研究工作揭示细胞凋亡和细胞增殖与分化同样具有重要的意义 机体内的 细胞随着生命过程的进行会不断的衰老 磨损 畸变 过剩 这些无用 衰老的细胞不仅是 机体的负担 还可能变为有害细胞 对机体造成威胁 通过凋亡可以将它们清除 因而细胞 凋亡是调节生物体正常发育和生命活动的一种不可缺少的机制 该调节一旦失败 可能导致 用心 爱心 专心 4 机体疾病 畸形甚至死亡 3 细胞凋亡与坏死 的区别 性质 主要特征 凋亡小体 炎症反应 细胞凋亡 生理性死亡 膜反折包裹胞内物 形成凋亡小体被吞噬 有 无 细胞坏死 病理性死亡 膜发生渗漏 胞内溶物释放到胞外 无 有 二 细胞凋亡的形态学特征 1 凋亡起始 该时期特征主要为 骨架杂乱 细胞间接触消失 细胞间粘附力下降 细胞质和核浓缩 显微镜下观察可发现细胞膜发泡 染色质凝集 沿着核膜形成新月 形帽状结构 内质网腔膨胀 核糖体从内质网上脱落 伴随着这些变化凋亡小体逐渐形成 2 凋亡小体形成 随着细胞膜内折 染色质断裂成片断 染色质片断及线粒体等细胞器反折的细胞膜包围 并逐渐分开 形成单个的凋亡小体 3 凋亡小体消失 凋亡小体被邻近的细胞或巨噬细胞识别吞食及消化 该过程一般较快 从凋亡开始到凋 亡小体形成不过几分钟的时间 整个凋亡过程大约持续几个小时 三 细胞凋亡的分子机制 1 caspase 家族与凋亡 caspase 是近年发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶 它们可 特异地断开天冬氨酸残基后的肽键 切割的结果是使某些蛋白活化或失活 由此细胞凋亡 2 天然的 caspase 抑制剂 细胞凋亡失机体用来清除病毒 防止其进一步感染的一种机制 而病毒也发展出一种对 抗机制 抑制 caspase 的活性 来逃避或阻止凋亡的发生 痘病毒蛋白 CrmA 和杆病毒蛋 白 p35 就是这样的天然的 caspase 抑制剂 3 Bcl2 家族 Bcl2 是一种原癌基因 是 ced9 在哺乳类中的同源物 Bcl2 能延长细胞的寿命 但不促 进细胞增殖 能抑制细胞凋亡 4 P53 与细胞凋亡 p53 是肿瘤抑制基因 其产物主要存在于细胞核内 p53 基因在人类肿瘤有关基因的突 变率最高 人类肿瘤的 50 以上是由 p53 基因的缺失造成的 将 p53 基因重新导入已转化的 用心 爱心 专心 5 细胞中 可能产生细胞凋亡或细胞生长阻遏两种结果 细胞凋亡的检测方法 一 形态学观察方法 1 HE 染色 光镜观察 凋亡细胞呈圆形 胞核深染 胞质浓缩 染色质成团块状 细 胞表面有 出芽 现象 2 丫啶橙 AO 染色 荧光显微镜观察 活细胞核呈黄绿色荧光 胞质呈红色荧光 凋 亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧 可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 3 台盼蓝染色 如果细胞膜不完整 破裂 台盼蓝染料进入细胞 细胞变蓝 即为坏 死 如果细胞膜完整 细胞不为台盼蓝染色 则为正常细胞或凋亡细胞 此方法对反映细胞 膜的完整性 区别坏死细胞有一定的帮助 4 透射电镜观察 可见凋亡细胞表面微绒毛消失 核染色质固缩 边集 常呈新月形 核膜皱褶 胞质紧实 细胞器集中 胞膜起泡或出 芽 及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬 细胞吞噬现象 二 DNA 凝胶电泳 一 检测原理 细胞发生凋亡或坏死 其细胞 DNA 均发生断裂 细胞内小分子量 DNA 片断增加 高分子 DNA 减少 胞质内出现 DNA 片断 但凋亡细胞 DNA 断裂点均有规律的发生在核小体之间 出 现 180 200bpDNA 片断 而坏死细胞的 DNA 断裂点为无特征的杂乱片断 利用此特征可以确 定群体细胞的死亡 并可与坏死细胞区别 二 结果判断 正常活细胞 DNA 电泳出现阶梯状 LADDER 条带 坏死细胞 DNA 电泳类似血抹片时的连 续性条带 三 酶联免疫吸附法 ELISA 核小体测定 凋亡细胞的 DNA 断裂使细胞质内出现核小体 核小体由组蛋白及其伴随的 DNA 片断组成 可由 ELISA 法检测 一 检测步骤 1 将凋亡细胞裂解后高速离心 其上清液中含有核小体 2 在微定量板上吸附组蛋白体 3 加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合 4 加辣过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体使之与核小体上的 DNA 结合 4 加酶的底物 测光吸收制 二 用途 该法敏感性高 可检测 5 100 ml 个凋亡细胞 可用于人 大鼠 小鼠的凋亡检测 该 法不需要特殊仪器 适合基层工作 但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量 用心 爱心 专心 6 四 流式细胞仪定量分析 一 检测原理 细胞发生凋亡时 其细胞膜的通透性也增加 但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间 利用这一特点 被检测细胞悬液用荧光素染色 利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强 度来区分正常细胞 坏死细胞核凋亡细胞 二 应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点 1 检测的细胞数量大 因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2 可以做许多相关性分析 3 结合被检测细胞的 DNA 含量的分析 可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 检测形态学及细胞膜完整性的 Hoechs PI 双染色法 细胞发生凋亡时 其细胞膜的通透性液增加 但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间 利用这一特点 被检测细胞悬液用荧光素染色 利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强 度来区分正常细胞 坏死细胞和凋亡细胞 利用 Hoechs PI 染色法 正常细胞对染料有抗拒性 荧光染色很浅 凋亡细胞主要摄取 Hoecha 染料 呈现强蓝色荧光 而坏死细胞主要摄取碘化丙啶 PI 而呈强的红色荧光 DNA 片断原位标记法 凋亡细胞 DNA 片断原位末端检测技术是指在细胞 或组织 结构保持不变的情况下 用 荧光素 地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸 deoxyuridinetriphate DUTP 和末端脱氧 核苷酸转移酶 TdT 相反应与凋亡细胞裂解后 3 的羟基 OH 端结合 经显色反应后检 测 DNA 裂解点的技术 DNA 片段原位标记法有二种 1 原位缺口转移 in situ nick translation ISNT 技术 它是利用 DNA 多聚酶 I 将 标记的核苷酸连接到断裂 DNA 的 3 OH 端 2 原位缺口末端标记技术 in situ end labelling technique ISEL 即 TUNEL 法 细胞凋亡中 染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3 OH 末端 可在脱氧核糖 核苷酸末端转移酶 TdT 的作用下 将脱氧核糖核苷酸和荧光素 过氧化物酶 碱性磷酸 酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3 末端 从而可进行凋亡细胞的检测 这类方法称 为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling TUNEL 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没 有 DNA 的断裂 因而没有 3 OH 形成 很少能够被染色 TUNEL 实际上是分子生物学与形态 学相结合的研究方法 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡