000001a4_林德峰-临床评价

基金项目 基金项目 国家自然基金课题 30873127 1 作者简介 作者简介 林德峰 1986 03 男 硕士研究生 从事药物化学与临床药理学研究 E mail lindefeng11 通讯作者通讯作者 钱金栿 教授 硕士生导师 Tel 0872 2219968 E mail jfqian 王睿 教授 博士生导师 Tel 010 66939409 E mail wangrui301 米诺环素与利福平联用对米诺环素与利福平联用对 100 株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗 菌活性菌活性 林德峰 1 于旭红2 白艳1 宋秀杰2 梁蓓蓓2 蔡芸2 白楠2 钱金栿1 王睿2 1 大理学院药学院 云南大理 671000 2 中国人民解放军总医院 临床药理研究室 北京 100853 摘要 目的摘要 目的 为了评价米诺环素和利福平对临床分离得到的100株耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌 Methicillin residtant Staphloccus aureus MRSA 的联合体外抗菌活性 探讨两 药联用的抗MRSA效应 方法方法 通过采用棋盘法设计 微量肉汤稀释法测定不同浓度组 合的抗菌药物对100株临床分离MRSA最低抑菌浓度 并计算部分抑菌浓度 Fractional Inhibitory Concentration FIC 指数判定联合效应 FIC指数的判定标准 FIC 0 5为协 同作用 0 5 4 为拮抗作用 结果结果 米诺环素和利福平联合 应用后 两种抗菌药物对临床分离得到的100株MRSA的MIC50显著降低 FIC指数分布情 况 FIC 0 5占92 0 5 4为0 结论结论 本研究结果表明米诺环素 利福平联合应用对 100 株临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抗菌效应表现为 以协同作用为主 无关作用较少 无拮抗作用 关键词 关键词 米诺环素 利福平 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 部分抑菌浓度 FIC 指数 联合药敏 In Vitro Activity of Minocycline in Combination with Rifampin on 100Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus Lin de feng1 Yu xu hong2 Bai yan1 Song xiu jie2 Liang bei bei2 Cai yun2 Bai nan2 Qian jin fu1 Wang rui2 1 College of pharmacy Dali University Yunnan 671000 China 2 The Chinese PLA 2 General Hospital Beijing 100853 China ABSTRACT Objective The objective of the study was to investigate the in vitro activity of Minocycline combined with Rifampin against MRSA Methods 100 strains of MRSA isolated from two China hospitals clinical specimens of human infections were used in this study The checkerboard method was used to determine the combinations activity against these strains The susceptibility results for Minocycline and Rifampin were interpreted according to the guidelines of the CLSI The FIC index was calculated according to MIC results antagonism was defined as FIC 4 indifference as FIC 0 5 and 4 and synergism as FIC 0 5 Results The MIC50 was reduced significantly for the combination of Minocycline and Rifampin against Staphylococcus aureus compare to use Minocycline and Rifampin alone The results of combination of Minocycline and Rifampin were 92 92 100 synergism 8 8 100 indifference minimum and maximum fractional inhibitory concentration index 0 13 and 0 53 respectively and no antagonism Conclusion combinations of Minocycline and Rifampin may show synergism for most MRSA and there was on antagonism which may be a future therapeutic alternative for infections caused by MRSA Keywords Minocycline Rifampin methicillin resistant staphylococcus aureus MRSA fractional inhibitory concentration FIC Index synergism 自英国首次检出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 methicillin resistant staphylococcus aureus MRSA 以来 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 Methicillin residtant Staphloccus aureus MRSA 在世界各地广泛传播日益加快 成为医院感染和社区获得 性感染的主要致病菌 1 4 2006年中国CHINET细菌耐药性监测显示MRSA在金葡菌感染 中的比例平均为76 3 MRSA这种 超级细菌 感染已经达到了严重的程度 5 MRSA感 染治疗的难度来源于多方面 其存在广泛的耐药性 MRSA的毒力提高 抗生素的不合 理应用等 6 2001年日本首次报道MRSA引起心内膜炎经万古霉素治疗无反应 7 万古 霉素及替考拉宁对MRSA的抗菌活性均有些下降趋势 还有对利奈唑胺及奎奴普丁 达福 普汀 quinupristin dalfopristin 耐药及治疗失败的报道 8 9 MRSA 不仅对 内酰 胺类抗菌药物耐药 而且也屡见对大环内酯类 四环素类 氨基糖苷类抗菌药物均耐药 3 的报道 10 11 目前抗MRSA感染的一线药物主要有万古霉素 替考拉宁 利奈唑胺等 更新的药物替加环素 达托霉素对MRSA也有良好效果 但缺少临床经验并且花费很高 当患者确认为重度MRSA感染时才选用万古霉素等一线药物 轻度的MRSA感染可以根据 药敏结果选择米诺环素 夫西地酸 利福平 氟喹诺酮类与其他药物联合应用 12 抗 生素联合应用可以降低药物的剂量 避免单药治疗出现的选择性耐药问题从而减低细 菌耐药的产生 新的抗生素的研究发展的遇到前所未有的尴尬的境地 由于细菌耐药 的产生使新的抗生素的研究开发的速度明显减慢 更多的药品研发的公司转向了其他 疾病的药物 13 14 1983 2007年间新的抗菌药物获得上市的比例下降了75 15 一种 新型药物有时在未大量上市就出现了耐药 16 一旦广泛用于临床 其耐药性迟早总会 出现 随着耐药性的不断增加 供选择的有效方案十分有限 所以全球的制药公司正 在寻找新的途径 其中之一就是对老的药物进行研究 17 米诺环素 minocycline 是一种高效 长效和低毒的新型四环素的半合成衍生物 1972年上市 盐酸米诺环素是目前临床使用最广的一种四环素类抗生素 主要对革兰 阳性菌 包括四环素耐药的金黄色葡萄球菌 链球菌属 脑膜炎双球菌等均高度敏感 有报道米诺环素与氨基糖苷类 奈替米星 联用对MRSA抗菌活性呈协同和相加作用 无拮抗作用 18 利福平属半合成利福霉素类广谱抗菌药 主要为抗结核一线用药 对金 黄色葡萄球菌有一定的抗菌作用 因细菌对利福平的耐药性产生很快 一般不应该单 独使用 19 文献报道利福平与其他抗生素联合作用于MRSA有协同作用 20 而且在临 床上利福平与达托霉素联合应用于金黄色葡萄球菌引起的心内膜脓毒症的治疗取得很 好的疗效 可作为在万古霉素治疗不理想的情况下优先考虑的治疗方案 21 未见米诺 环素与利福平两药联合应用报道 本实验拟通过研究米诺环素与利福平对100株MRSA 的联合体外抗菌效应 本项研究旨在通过体外米诺环素与利福平联合药敏实验为评价 体外联合抗MRSA效应提供可靠的实验依据 为进一步的体内实验以及临床合理用药 提供依据 1 1材料与仪器材料与仪器 1 11 1 菌株来源菌株来源 100株分别来自中国人民解放军总医院2008年1月至2009年9月间和北京 协和医院2009年1月至2009年11月期间的MRSA非重复临床分离菌株 其中50株来源于呼 吸道 29株来源于血培养 5株来源于尿液 4株来源于脓包分泌物 12株来源于其他外 科伤口等 用15 甘油 脑心浸液分装后放置 80 冰箱保存 测定前复苏 经VITEK 重 4 新鉴定 并用头孢西丁纸片确认为MRSA ATCC29213购自中国药品生物制品检定所 1 21 2 培养基培养基 Muller Hinton MH 肉汤和Muller Hinton MH 琼脂 美国Difco 公司产 品 乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒购 法国Bio Merieux公司 1 31 3 抗菌药物抗菌药物 米诺环素标准品 中国药品生物制品检定所 批号130514 200401 纯 度为85 10 利福平标准品 中国药品生物制品检定所 批号130496 200702 纯度 为98 00 头孢西丁药敏纸片 中国药品生物制品检定所 1 41 4 仪器仪器 比浊仪 法国梅里埃公司 连续微量加样器 美国Eppendorf 公司 八 导微量加样器 美国Eppendorf 公司 96 孔平板 爱思进医用塑料 台州 有限公司 DHP 9162电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司 2 2方法方法 2 12 1 MRSAMRSA鉴定鉴定 临床分离的100株MRSA菌株均用乳胶凝集法金黄色葡萄球菌鉴定试剂盒重新鉴定确 认 按美国临床实验室标准化委员会 Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI 抗生素敏感试验执行标准 6 6 用头孢西丁纸片进行筛选确认 头孢西丁 每片30 g 纸 片对102株金黄色葡萄球菌做药敏试验 头孢西丁纸片抑菌圈直径 19 为耐药 则可确 定为MRSA 2 22 2 菌悬液配制菌悬液配制 从已分纯并过夜新鲜培养的细菌平板上挑取4 5 个菌落 接种于MH 肉汤中增菌 6h 恒温 震荡培养 菌液用3ml MH 肉汤校正比浊仪浊度至0 5MacFarland 再用MH 肉汤稀释至1 5 105 cfu mL 1 2 32 3 抗菌药物储备液配制抗菌药物储备液配制 按照表表1 1所示 精密称取适量米诺环素和利福平 根据CLSI2009以相应溶剂溶解 于25mL容量瓶中定容 含药储备液浓度均为1024 g mL 1 然后进行分装冷藏 备用即 可 表表1 抗菌药物储备液的配制抗菌药物储备液的配制 Tab1 The preparation of antibiotics conuntrative solution antibacterials solvent density g mL 1 Minocycline sterile distilled water 1024 Rifampicin Methanol and sterile distilled water 1024 5 2 42 4 微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法 22 将米诺环素以灭菌MH 肉汤倍比稀释成7个浓度 分别为16 8 4 2 0 25 g mL 1 利福平以灭菌MH 肉汤倍比稀释成11个浓度 分别为 1024 512 4 2 g mL 1 将配好不同浓度的两种抗菌药物按棋盘法设计 两两组合加 入96 孔平板中 每种抗菌药物取50 L 再将1 5 105 cfu mL 1的菌液100 L加入孔中 35 过夜 16 20h 培养 观察结果 记录单独应用两药的最低抑菌浓度MIC甲药单用和MIC 乙药单用 并选择最佳组合效应时 两药联合时各自的MIC甲药联用和MIC乙药联用 以计算FIC 指 数 2 52 5 MICMIC结果判定标准结果判定标准 采用微量肉汤稀释法进行抗菌药物最低抑菌浓度测定 无菌生长96孔平皿的最低 药物浓度为该药对该株细菌的最低抑菌浓度 Minimal Inhibitory Concentration MIC 米诺 环素和利福平对MRSA的折点判定按CLSI2009年标准 见表见表2 质控跟随每批试验 以 确保整个实验的准确性 表表2 CLSI规定抗菌药物对葡萄球菌规定抗菌药物对葡萄球菌MIC判定标准判定标准 g mL 1 Tab2 CLSI MIC Interpretive Standards for Staphylococcus spp g mL 1 MIC g ml antibacterials SIR Minocycline 48 16 Rifampicin 12 4 S sensitive I intermedial R resistance 2 62 6 FICFIC 指数计算与判读标准指数计算与判读标准 23 24 见表见表3 3 FIC 指数 MIC甲药联合 MIC甲药单用 MIC乙药联合 MIC乙药单用 表表 3 两药联合应用两药联合应用 FICI 判定标准判定标准 Tab3 The following formula to calculated The FICI of the drug A and B in combination and the criterion 3 3结结果果 3 13 1 米诺米诺 环素环素单用单用 FICI 0 5 synergism 0 5 FICI 4indifferent FICI 4antagonistic 6 与利福平单独应用对与利福平单独应用对 MRSA 的的 MIC 及耐药性及耐药性 见表见表 4 4 由表4可见 米诺环素对MRSA的MIC范围较窄 0 5 8 MIC50 是2 g mL 1 MIC90是4 g mL 1 MRSA对米诺环素敏感率为95 利福平对MRSA的MIC范围较宽 8 256 MIC50 和MIC90是256 g mL 1 本实验中的MRSA菌株对利福平严重耐药 耐药率100 3 23 2 米诺环素与利福平联合应用对米诺环素与利福平联合应用对MRSA的的MIC 见表见表5 由表5可见 米诺环素与利福平联用对100株MRSA的MIC50 MIC90分别为 0 5 1 g mL 1 而单独应用米诺环素时 MIC50 MIC90 为2 4 g mL 1 联合用药比单 用米诺环素的几何均数 MICG 下降4倍 利福平与米诺环素联用对100株MRSA的MIC50 MIC90分别为16 64 g mL 1 而单独应用利福平时 MIC50 MIC90 为256 g mL 1 联 合用药比单用利福平的几何均数 MICG 下降13倍 提示两者有较明显的协同作用 3 33 3 米诺环素利福平联合应用的米诺环素利福平联合应用的 FIC 指数分布指数分布 图 1 由图 1 可以看到 米诺环素与利福平联合应用 FIC 指数分布 92 株为 0 5 表明其对 MRSA 多数呈协同作用 92 极少表现无关作用 8 无拮抗作用 FIC 指数的范围 是 0 13 0 53 3 43 4米诺环素和利福平单用和联合应用浓度米诺环素和利福平单用和联合应用浓度 累积抑菌百分率曲线累积抑菌百分率曲线 图 2 由图 2 我们可以看到 米诺环素和利福平联合应用与单用相比 累积抑菌曲线均显著 左移 表明米诺环素和利福平联合抗菌作用相互增强 米诺环素与利福平联用时最低的抑 菌浓度是 0 125 g mL 1 米诺环素浓度为 0 5 g mL 1时就可以抑制 50 的菌株 利福平 与米诺环素联用时最低的抑菌浓度是 1 g mL 1 利福平浓度为 16 g mL 1时就可以抑制 50 的菌株 4 4讨论讨论 细菌的耐药性迅速发展 已成为临床急需解决的问题 WHO 呼吁成员国采取措施促 进抗生素合理应用 将细菌耐药列为全球公共卫生安全的威胁之一 制定应对细菌耐 药的全球策略 25 26 金黄色葡萄球菌的主要耐药就是 MRSA 2006 2007 年 Mohnarin 检 测结果显示 27 MRSA 检出率为 61 6 2008 年 CHINET 5 的 MRSA 检出率为 55 9 在国 内虽然还没有发现万古霉素耐药的 MRSA 但是 MIC 分布呈升高趋势 但是美国 CDC 在 2002 年 7 月正式公布第一株真正耐药的耐万古霉素的葡萄球菌 Vancomycin Resistant Staphylococcus Aureus VRSA 28 国外也报道了在体内分离到的耐利奈唑胺金黄色葡 7 萄球菌 29 31 多重耐药的革兰阳性菌所致感染的发生率逐年升高 特别是 MRSA 对当 前常用的 内酰胺类 四环素类 氨基糖苷类和大环内酯类抗生素耐药 29 30 给临 床选择适当的药物提出了很大的挑战 MRSA 引起的感染单一用药往往不能获得较好的疗效 主张采用抗菌药物联合应用 来治疗 抗菌药物联合应用的意义在于考察两种或两种以上的抗菌药物联合应用于某 种细菌时是否有协同抗菌作用 增强体外联合抗菌效应 发挥两药迅速而强大的杀菌 作用 减小诱导细菌产生耐药性突变频率 降低抗菌药物的用药剂量 减少或避免严 重不良反应的发生 应用体外实验呈协同效应的抗菌药物组合 可望得到较高的临床 治愈率 因此临床寻找联合应用以降低毒副作用并能显著提高疗效的药物组合显得十分 迫切 本实验中米诺环素与利福平联合应用于体外抗 MRSA 可显著降低两药单独应用时 的用药剂量 单用米诺环素对 100 株 MRSA 的 MIC90为 4 g mL 1 而联合应用利福平后 MIC90下降到 2 g mL 1 联合用药比单用米诺环素的平均值 MICG 下降 4 倍 而单用利 福平对 100 株 MRSA 的 MIC90为 256 g mL 1 而联合应用米诺环素后 MIC90 下降到 64 g mL 1 联合用药比单用利福平的平均值 MICG 下降 13 倍多 提示两者有较明显 的协同作用 米诺环素与利福平单用与联合应用浓度 累积抑菌百分率曲线结果显示 两药联合应用与单用相比 累积抑菌曲线显著左移 表明米诺环素与利福平的抗菌作用 相互增强 米诺环素与利福平合应用 FICI 分布多数集中在 0 0 5 表明其对 MRSA 多数 呈协同作用 协同作用为 92 同时无关作用为 8 无拮抗作用 从本实验结果可以看出 通过两种药物的联合应用 一方面提高了抗菌效果 同时又降低两种药物的用药剂量 使药物的不良反应降低 同时降低的耐药的发生 米诺环素对 MRSA 的作用与其他四环素类相比敏感性较强 耐药率降低 其原因是 在四环素的第 7 位上引进 2 个甲基 使其脂溶性有所提高 增加了对细菌细胞膜的通 透性 其作用机制是与核糖体 30S 亚基的 A 位置结合 阻止肽链的延长 从而抑制细菌 或其他病原微生物的蛋白质合成 利福平半合成的利福霉素类衍生物在细胞内外均有 明显的杀菌作用 作用机制为抑制菌体多聚酶的活性 阻止细菌 mRNA 的形成 从而阻 断菌体蛋白的合成 两药作用于细菌蛋白质过程的不同阶段 共同导致细菌蛋白质合 成受阻 两药联用大部分呈相加作用便得到了合理的解释 从本实验结果可以看出 通过两种药物的联合应用 一方面提高了抗菌效果 同时又 降低两种药物的用药剂量 使药物的不良反应降低 总之 本文发现米诺环素与利福平 8 联合应用对 100 株临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抗菌效应表现为以协同作 用为主 无关作用较少 无拮抗作用 对动物实验以及临床实验的研究提供了依据 表表4 米诺环素与利福平单用对米诺环素与利福平单用对MRSA的的MIC结果结果 g mL 1 n 100 Tab4 The MIC of Minocycline or Rifampin alone on MRSA g mL 1 n 100 Strain Antibacterials MIC range MIC50 MIC90 MICG S I R MRSA Minocycline 0 5 8 2 4 2 8 95 5 0 Rifampicin 8 256 256 256 219 8 0 0 100 S sensitive I intermedial R resistance 表表5 米诺环素与利福平联用对米诺环素与利福平联用对MRSA的的MIC结果结果 g mL 1 n 100 Tab5 The MIC of Minocycline combined with Rifampin against MRSA g mL 1 n 100 Strain Antibacterials MIC range MIC50 MIC90 MICG MRSA Minocycline 0 125 2 0 5 1 0 70 Rifampicin 1 64 16 64 16 4 图图 1 1 米诺环素与利福平米诺环素与利福平联合应用对联合应用对 MRSA FIC 指数分布指数分布 n 100 Fig 1 Fractional inhibitory concentration index FICI of Minocycline combined with Rifampin in MRSA n 100 9 0 20 40 60 80 100 0 0 50 5 4 FICI n 图图2 2 米诺环素和利福平单用和联合应用浓度米诺环素和利福平单用和联合应用浓度 累积抑菌百分率曲线累积抑菌百分率曲线 n n 100 100 Fig 2 The cumulative inhibition ratio CIR of Minocycline and or Rifampin against MRSA n 100 0 20 40 60 80 100 120 0 125 0 250 51248163264128256 C g ml CIR Minocycline alone Minocycline combination Rifampicin alone Rifampicin combination REFERENCES 1 Thornsberry C Epidemiology of staphylococcal infections a USA perspective J Journal Chemotherapy 1994 2 61 5 2 Vandenbroucke Grauls C Epidemiology of staphylococcal infections a European perspective J Journal Chemotherapy 1994 2 67 70 3 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