十六、乙型脑炎检测方法

十六 乙型脑炎检测方法十六 乙型脑炎检测方法 猪乙型脑炎乳胶凝集试验 猪乙型脑炎乳胶凝集试验 LAT 诊断试剂盒使用说明书 诊断试剂盒使用说明书 猪乙型脑炎是由流行性日本乙型脑炎病毒 JEV 引起的猪的一种繁殖障碍 性疾病 此病引起妊娠母猪流产 死胎 木乃伊胎 公猪睾丸肿胀 萎缩 丧 失配种能力及新生仔猪痉挛死亡 临床上该病多呈散发 流行常发生于蚊虫滋 生的炎热季节 患畜病初体温升高 精神沉郁 跛行 有神经症状 病愈后隐 性带毒 种猪表现繁殖障碍 该病给养猪业带来较大的经济损失 猪乙型脑炎乳胶凝集试验是用乙脑弱毒疫苗毒株经纯化 浓缩等程序后致 敏乳胶 制成乳胶凝集试验用抗原 用于检测动物血清中的乙脑病毒抗体 可 在现场进行 具有安全 简便 快速 特异 敏感之优点 1 试剂盒的内容 试剂盒的内容 本品包括猪乙型脑炎致敏乳胶抗原 阳性血清 阴性血清 稀释液 玻片 吸头及使用说明书 2 制品用途 制品用途 用于猪乙脑血清学诊断 3 使用方法 使用方法 3 1 定性试验 取待检样品 血清 阳性血清 阴性血清 稀释液各一滴 约 15 微升左 右 分别置于玻片上 再各加乳胶抗原一滴 用牙签混匀 搅拌并摇动 1 2 分 钟 于 3 5 分钟内观察结果 3 2 定量试验 先将血清作连续稀释 各取 1 滴依次滴加于乳胶凝集反应板上 另设对照 同上 随后再各加乳胶抗原一滴 如上搅拌并摇动 判定 4 结果判定 结果判定 4 1 对照试验 出现如下结果试验方可成立 否则应重试 阳性血清加抗原呈 阴性血清加抗原呈 抗原加稀释液呈 4 2 判定标准 全部乳胶凝聚 颗粒聚于液滴边缘 液体完全透明 大部分乳胶凝集 颗粒明显 液体稍混浊 约 50 乳胶凝集 但颗粒较细 液体较混浊 有少许凝集 液体呈混浊 液滴呈原有的均匀乳状 以出现 以上凝集为阳性 5 贮藏贮藏 在 2 8 冷暗处保存 有效期暂定 1 年 6 6 附注 附注 被检样品采集及处理方法 6 1 血清 按常规方法分离血清 要求无腐败 6 2 使用前应轻轻摇匀乳胶抗原 吴 斌 猪乙型脑炎血凝抑制试验操作方法猪乙型脑炎血凝抑制试验操作方法 一 实验血清处理 1 非特异性抑制素除净法 取 0 1 毫升血清 未稀释 加 0 9 毫升 12 5 高 岭土 或白陶土 溶液 混合后放室温中 20 分钟 然后以约 2500 转 分 钟离心 15 20 秒 上清液即为 1 10 的血清 2 非特异性凝集的除净法 经高岭土 或白陶土 处理好的血清 加入 30 6 4 盐水配 鸽或鹅血球 0 1 毫升 中间振荡混合 2 3 次 在 37 或 4 过夜 然后 1500 转 分离心 10 分钟 上清液即可作 HI 试验血清 二 配制 4 个单位血凝素 按血凝素滴定结果配制 血凝素单位滴度测定 1 取已处理之清洁干燥微量料板 2 手持吸入 pH9 0 盐水之微量吸管直立滴入各孔中 每孔 1 滴为 0 025 毫 升 3 用稀释棒蘸取 0 025 毫升血凝素于第一孔中 也可用微量吸管取 0 025 毫升血凝素加入第一孔中 再用稀释棒作倍比稀释 棒在每孔中要直立 旋转 30 50 次 使血凝素充分混匀 出孔时勿碰孔壁 孔号 成分 123456 血球 对照 9 0 盐水 ml 血清 1 10ml 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 弃 0 025 0 025 0 5 血凝集 4 单位 ml 0 0250 0250 0250 0250 0250 025 0 5 鸽血球0 050 050 050 050 050 050 05 混匀加盖 1 小时 三 血凝抑制操作方法按下表进行 孔号 成分 1234567 血清 对照 血球 对照 9 0 盐水 ml 血清 1 10ml 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 0 025 弃 0 025 血凝集 4 单位 ml 0 0250 0250 0250 0250 0250 0250 0250 0250 025 混匀 加盖置 4 过夜或室温 2 小时 0 5 鸽血球0 050 050 050 050 050 050 050 050 05 混匀 放室溫 1 2 小时观察结果 吴 斌 乙型脑炎反转录聚合酶链反应 乙型脑炎反转录聚合酶链反应 RT PCR 1 材料准备 材料准备 待检材料 组织匀浆器 TEN 缓冲液 氯仿 无水乙醇 异丙醇 75 乙醇 TRI20L 裂解液 RT PCR 试剂盒 引物 扩增乙型脑炎病毒中 447 P77 之间 50 bp 基因片段 由上海生物工程公司合成 其序列为 上游引物 5 TCA TGT GGC TCG CGA GC 3 下游引物 5 TCT GTA AGC CGG AGC G 3 仪器设备 凝胶电泳紫外检测仪 PCR 扩增仪 电泳仪 2 操作步骤 操作步骤 2 1 样品采集 对于病死或扑杀动物 取脑组织 脑脊髓液血清等 对于待检活猪 无 菌采集血液 收集血清 冷藏送检 2 2 病毒 RNA 抽提 所采病料经组织研磨器充研磨 按 1 5 用 TEN 缓冲液悬浮收集 于离心管中 反复冻融 3 次后经 7000rpm 离心 5 分钟 取上清液 取上清液 或血清 250 l并加入 750 l TRIIOL 裂解液于室温作用 10 15 分钟 加入氯仿 200 l 剧烈振荡 室 温下放置 10 15 分钟 再于 12000rpm 离心 15 分钟 待分层以后 吸虫上层水相约 500 l 加入等体积的异丙醇 混合后置室温下沉淀 RNA 用适量的灭菌 DEPC 水溶解 立 即进行 RT PCR 2 3 RT PCR 操作程序 按 RT PCR 试剂盒操作说明书进行 反应体系 50 l 组成如 下 10 缓冲液 5 l 25mM MgCh 10 l 10mM dNTPs 5 l RNA 酶抑制剂 1 l AmV Rtase XL 1 l AmV optimized Taq 1 l 引物 2 l Template 10 l 灭菌 DEPC 水 13 l 反转录条件为 50 30