western blot步骤

Western blot protocol 步骤 步骤 1 分离胶和积层胶 制胶板 注意 灌分离胶时不要加太多 2 蛋白变性 准备蛋白样本 加入等体积的 2 上样 Buffer 稀释 置于沸水中 煮 10min 预染 marker 煮 5min 3 加样 每孔加入 20 40 l 样品 4 电泳 置于电泳槽中电泳 45min 恒定电流 90mA 2 块板 如为 1 块板则 电流为 50mA 5 取出胶板 用切割刀修好胶 6 将胶置于转膜液中浸泡 7 按顺序放好下列物质 黑面 海绵 滤纸 胶 NC 膜 滤纸 用吸管赶去 气泡 海绵 8 置于转膜槽中于 黑面对黑面 加上冰块 加入转膜液 9 装好电极 于恒定电压 100V 下 90min 10 丽春红染膜 11 用 TBST 洗去丽春红 12 封闭 加入 5 脱脂奶粉 TBST 常温摇床摇 1h 13 回收封闭液 加入一抗 一抗用 5 BSA TBS 稀释 14 置于 4 摇床摇过夜 15 回收一抗 TBST 洗膜 10min 共 3 次 16 加入二抗 二抗用 5 脱脂奶粉 TBS 稀释 常温摇床摇 1h 17 回收二抗 TBST 洗膜 10min 共 3 次 18 将膜置于发光液中浸泡约 1min 19 将膜铺于曝光盒中 于暗室中曝光 洗胶片 常用溶液配制 常用溶液配制 细胞裂解液 细胞裂解液 PLC Lysis Buffer Final concentration100ml500ml 1M Hepes pH7 5 50mM5ml25ml 5M NaCl150mM3ml15ml Glycerol10 10ml50ml 50mM MgCl21 5mM3ml15ml Triton 1001 1ml5ml 0 5M EDTA pH8 0 1mM200 l1ml 0 1M NaPPi10mM10ml50ml 0 5M NaF10Mm2ml10ml 每次提取蛋白前加入 1 蛋白酶抑制剂 SDS PAGE 胶配方及其它常用溶液的配制胶配方及其它常用溶液的配制 1 30 丙烯酰胺丙烯酰胺 丙烯酰胺 29g N N 亚甲双丙烯酰胺 1g 溶于总体积为60ml的水中 加热至37 使其溶解 补加水至终体积为100ml 用 Nalgene滤器 0 45 m孔径 过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤 查证该溶液的pH值不大于 7 0 置棕色瓶中保存于RT 注 1 丙烯酰胺是强烈的神经毒素 可经皮肤吸收 丙烯酰胺的作用具累积性 2 称取时 必须戴手套 口罩 取溶液时也要戴手套 3 贮存期间 丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸 这一脱氨反应 是光催化和碱催化的 应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7 0或更低 并应在RT下避光保 存 每隔数月应重新配制溶液 2 3M Tris HCl pH8 8 用于分离胶 用于分离胶 Tris碱分子量为121 1 将72 66gTris碱溶于重蒸水 不超过200ml 中 加浓盐酸调节pH 至8 8 让溶液泠却至RT 再最终调至所需pH值 加重蒸水定容至200ml 1 034 105 Pa 20min高压灭菌 RT贮存 注 1 如溶液呈现黄色 应予丢弃 并置备质量更好的Tris 2 Tris溶液的pH值因温度而异 温度每升高1 pH值大约降低0 03个单位 3 2M Tris HCl pH6 8 用于积层胶 用于积层胶 同上方法 将48 44gTris碱加重蒸水定容至200ml 加浓盐酸调节pH至6 8 4 10 十二烷基硫酸钠 十二烷基硫酸钠 SDS 在900ml水中溶解100g电泳级SDS 加热至68 助溶 加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值 至7 2 加水定容至1L 分装备用 注 SDS的微细晶粒易于扩散 因此称量时要戴面罩 称量完毕后要清除残留在称量工 作区和天平上的SDS 10 SDS溶液无须灭菌 5 TEMED N N N N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺 TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合 由于 TEMED只能以游离碱的形式发挥作用 因此pH值较低时聚合反应受到抑制 6 10 过硫酸胺过硫酸胺 过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基 可用去离子水配制小量 10 W V 的贮存液于保存于4 由于过硫酸铵会缓慢分解 故应隔新鲜配制 方法 把 1gAPS 溶解于终量为 10ml 水溶液中 4 保存数周 7 电泳缓冲液电泳缓冲液SDS buffer 10X running buffer Tris base 30 3g Glycine 144 0g SDS 10 0g ddH2O to 1L 1X conc 25mM Tris base 192mM glycine 0 1 SDS 8 转膜缓冲液转膜缓冲液Transfer Buffer 10 pH8 3 Tris base 30 3g Glycine 144 0g 20 v v methanol Fresh ddH2O to 1 L 1X conc 25mM Tris base 192mM glycine 200ml methanol 9 TBST 10X pH 7 5 Tris base 24 2g NaCl 80 0g Tween 20 10 ml ddH2O to 1L 1X conc 100mM Tris base 150mM NaCl 0 1 Tween20 10 Tris缓冲盐溶液缓冲盐溶液 1X TBS 25mmol L Tris NaCl 8 0g KCl 0 2g Tris碱 3 0g 溶解于 800ml 蒸馏水中 加入 0 015 酚红并用 HCl 调 pH 值至 7 4 用蒸馏水定容至 1L 分装后在 15lbf in2 1 034 105 Pa 高压下灭菌 20min RT 贮存 1111 发光剂 发光剂 100mM Tris Base pH8 5 10 ml 250mM Luminol in DMSO 50 l 90mM P Coumaric Acid in DMSO 22 l 30 H2O2 2 75 l SDS PAGE Mini Gel Recipes 7 Running Gel 10 Running Gel 12 Running Gel gels24 Acrylamide bis acrylamide ml 4 89 6 3M Tris HCL pH 8 8 ml 1 53 0 ddH2O ml 5 4810 96 10 SDS ul 120240 10 APS ul 100200 TEMED ul 612 15 Running Gel gels24 Acrylamide bis acrylamide ml 612 3M Tris HCL pH 8 8 ml 1 53 0 ddH2O ml 4 288 56 10 SDS ul 120240 10 APS ul 100200 TEMED ul 612 Stacking Gel gels24 Acrylamide bis acrylamide ml 48 3M Tris HCL pH 8 8 ml 1 53 0 ddH2O ml 6 2812 56 10 SDS ul 120240 10 APS ul 100200 TEMED ul 612 gels2 4 Acrylamide bis acrylamide ml 2 85 6 3M Tris HCL pH 8 8 ml 1 5 3 0 ddH2O ml 7 48 14 96 10 SDS ul 1202