JWA基因剔除小鼠胚胎成纤维细胞

JWA 基因对小鼠胚胎成纤维细胞恶性转化及细胞周期的影响摘要：目的摘要：目的 JWA 基因是一个新发现的受维甲酸诱导、与细胞分化调节有关的细胞骨架样基因。本研究探讨建立 JWA 基因剔除小鼠 MEF 细胞恶性转化的细胞模型。方法方法 选取野生型小鼠的 MEF 细胞和被敲除 JWA 基因的小鼠 MEF 细胞分别进行体外培养，对 MEF 细胞的生长形态、生长曲线等进行对比分析，推断两种细胞的增殖能力。流式细胞仪检测细胞周期改变。Westernblot 法检测细胞周期蛋白表达改变。结果结果 敲除 JWA 基因的 MEF 细胞增值速度较快，细胞数目较多。细胞周期检测可见 JWA 基因敲除小鼠 MEF 细胞中可见周期异常细胞，细胞周期蛋白 cyclingD1 表达升高。结论结论JWA 基因剔除可促进 MEF 细胞恶性转化。关键词关键词 MEF 细胞；小鼠；JWA 基因The effect of JWA on malignant transformation and cell cycle in mouse embryonic fibroblasts (MEF) cellStudent: Jiadong HuangGuided teacher: Hong QiAbstract：Objective To investigate the effect of malignant transformation in mouse embryonic fibroblasts (MEF) and transformation mechanisms. Methods We choose MEF cells from wild-type mice and mice whose JWA gene was knocked out, culture in vitro, and analyze the growth morphology and growth curve of MEF cells, then transfer the proliferation in two kinds of MEF cells. Results MEF cells whose JWA gene were knockout proliferated faster, and thenumber of cells was increased. Conclusion JWA gene in mice is anti-cancer and anti-aging genes.Keywords: MEF cells; mice; JWA gene JWA 基因是在 1998 年从培养的原代人的气管和支气管上皮细胞中，利用差异显示反转录聚合酶链反应高通量筛选技术，分离克隆的一个受维甲酸诱导的与细胞分化调节有关的新的细胞骨架样基因，该基因登录在 NCBI 基因库中，其编号为 AF0705231。JWA 基因广泛存在于多种动物组织(人、鼠、猴等)和培养细胞中(S 一 6、HBE、H178、H358、H5935、H431、H183、H549 等细胞株以及原代培养的人猴气管支气管上皮细胞)，且大多呈高表达。JWA 基因是一种环境应答基因，受多种诱导分化剂的调节，与细胞分化和凋亡相关，广泛参与细胞对应激刺激的应答，参与 DNA 损失和修复过程。其基因多态性与多种恶性肿瘤尤其是消化道肿瘤易感性相关1,2。JWA 基因还与多种恶性肿瘤发生机制有关，已证实与急、慢性粒细胞白血病有明确关系。另外用 A 参与调节肿瘤细胞的迁移，起类似抑癌基因的作用3。可以相信，随着分子生物学的不断发展和对该基因的更深人的研究，对关于 JWA 抑制肿瘤细胞迁移的确切机制、其在恶性肿瘤发生，发展和转移过程中的作用、是否能成为观察肿瘤患者预后及转移的指标等问题都将得到揭晓。1 材料与方法材料与方法1.11.1 材料材料1.1.1 实验动物:清洁级 BALB/c 小鼠，68 周龄。购回后饲养观察 12 周，选取精神状况良好的雌、雄鼠，按 3:l 比例合笼，次日早 8:00 前检查，有阴道栓者记为妊娠 0.5d，以此推算雌鼠怀孕日龄，实验过程中选择不同孕期雌鼠获取胚胎。1.1.2 实验试剂：DMEM(GIBCO 公司产品)，胎牛血清(Hyclone 公司)，胰蛋白酶(SIGMA 公司)，新生牛血清(GIBCO 公司)，高糖 DMED 培养基、0.25胰蛋白酶；00.02EDTA(GIBCO 公司)；半乳糖苷酶细胞衰老染色试剂盒；紫外交联仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)，琼脂、胎牛血清(FCS)，3戊二醛固定液、瑞氏、吉姆萨染液等。1.21.2 方法方法1.2.1 原代 MEF 分离培养4：将孕鼠处死，取出子宫，PBS 洗涤，除去血迹。剪开子宫，撕破胎膜，取出胎鼠，PBS 洗涤。将胎鼠躯干剪成 1mm 以下的碎块，吸置于离心管内，静置 510min，弃去上层液体。装有鼠胚组织碎块的离心管内加入 1ml 消化液，轻轻吹吸 30s，加入等体积培养液终止消化，室温下静置510min，收集上层细胞悬液。重复操作 1 次，弃去组织块。将收集到的细胞悬液 8001000r/min 离心 5min，弃去上清。培养液重悬细胞至培养瓶中，37qC、5CO 饱和湿度培养箱内培养。1.2.2 继代 MEF 分离培养4：继代培养法常应用于成纤维细胞的纯化，即原代MEF 生长铺满培养瓶的 8090时，用 025胰蛋白酶消化液消化传代，在显微镜下观察消化过程，见细胞变圆后立即以完全培养液终止消化。37，5CO，中培养，隔天换液。在 MEF 的分离过程中往往混杂有一定量的上皮样细胞，影响 MEF 的纯度和活性。将野生型小鼠 MEF 细胞定为对照组，记为mef+/+，将敲除 JWA 基因的小鼠 MEF 细胞定为实验组，记为 mef-/-。1.2.3 生长曲线：本实验主要采用 CCK-8 法6,7，CCK-8 法中的 CCK-8 试剂中含有 WST-8，WST-8 在电子载体的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲腊物，生成的甲腊物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，便可检测出待测细胞样品的活性。取处于指数生长期的细胞，调节细胞的浓度，使得细胞的个数为 45x10 个，将细胞接种到 96 孔板中，每个实验条件设置 6 个复孔；在相应的实验孔分别加入 MTY 试剂和 CCK-8 试剂。在加入不同试剂后分别继续培养 1h 一 7h；达到培养所需时间后，使用酶联免疫检测仪测量细胞液的 A 值。1.2.4 集落形成实验9：1.2琼脂加热溶化，置 46水浴中备用。计数已制备的骨髓单个核细胞，悬于 400C 预热的 40FCSRPMI1640 培养基中，24 孔培养板中每孔加 325l 上述细胞悬液,加入待检样品 50l，混匀。吸取预热的12琼脂 125l，轻柔而迅速地与上述细胞悬液和待检样品混合液于 24 孔板中混匀，注意勿产生气泡。自然凝固后，置 37、5CO2孵箱中培养，至810 d 后，于显微镜下观察。1.2.5 细胞周期检测: 1.2.6 Western blot 检测: 收获细胞用 1PBS 洗 2 次，用角质蛋白提取液（1 Triton-X 100、2 10-5 mol / L Tris，pH 70、06mol / L KCl、103 mol / L PMSF）裂解细胞，12 000 r / min，离心 20 min 后取上清液，Bradford 比色法（595 nm）测定蛋白质含量。加样到 145聚丙烯酰胺凝胶电泳；100 V，2 h 转至 PVDF 膜。一抗为 1200 稀释，37孵育 2 h；二抗为羊抗兔 IgG-HRP 1400 稀释，37孵育 1 h。ECL 检测按试剂盒说明操作进行显色反应。2 结结果与分析果与分析2.1建立建立 JWAJWA 基因剔除小鼠恶性转化细胞模型基因剔除小鼠恶性转化细胞模型取胚胎小鼠 MEF 细胞，体外培养，JWA 基因剔除小鼠的 MEF 细胞在体外培养 8个月之后形态与对照组野生型细胞相比形态发生明显改变，如图 1A。JWA 剔除小鼠 图 1A 图 1BMEF 细胞生长失去接触抑制，外形不规则，大小不一致，推测可 JWA 基因剔除小鼠 MEF 细胞可能发生了恶性转化2.22.2 JWAJWA 基因剔除小鼠基因剔除小鼠 MEFMEF 细胞恶性转化模型的鉴定细胞恶性转化模型的鉴定2.2.1细胞形态检测：用 Giemsa 染液分别对 JWA 基因剔除小鼠（mef-/-）和野生型小鼠 MEF（mef+/+）细胞染色如图 2。JWA 基因剔除小鼠的 MEF 细胞与野生型小鼠 MEF 细胞相比，到细胞核明显变大，胞浆变少，表现出恶性细胞的表型。图 2A 图 2B图 2 MGG 染色可将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色A 为 mef-/-组细胞镜检结果，B 为组 mef+/+细胞镜检结果。2.2.2 细胞增殖能力检测：用 CCK8 染液检测测细胞生长速度如图 3。JWA 基因剔除小鼠 MEF 细胞在接种至培养板后细胞生长速度明显快于对照组野生型小鼠MEF 细胞。图 3 两组 Mef 细胞经 CCK-8 法培养后细胞液的吸光度情况横坐标为细胞培养时间，纵坐标为细胞液的吸光度，比较mef-/-组和 mef+/+组的吸光度。2.2.4 集落形成实验：将 JWA 基因剔除小鼠 MEF 细胞和野生型小鼠 MEF 细胞接种于软琼脂中，观察细胞的集落形成能力，如图 4。结果发现 mef-/-组中细胞形成集落的能力明显高于野生型 MEF 细胞。因为细胞发生恶性转化的明显特征之一是细胞能够在软琼脂内形成集落，说明 JWA 基因剔除动物的细胞发生了恶性转化。00.20.40.60.811.21.412345dayAmef-mmef-mef+mmef+集落形成实验020406080100120140160180mef-/-mef+/+集落数图 4mef+/+组和 mef-/-组中经培养基培养后集落形成情况3 讨讨 论论本实验研究无 JWA 基因的小鼠 MEF 细胞恶性转化情况，采用基因敲除技术，获得所要研究的 MEF 细胞，体外培养后对其生长形态、生长曲线等进行分析，推断细胞的增殖能力。从生长曲线可以看出 mef-/-组细胞第 12 天生长平缓，与对照组细胞相比生长速度差别不大，而 34 天生长速度比对照组明显加快。血清饥饿实验结果中可以看出第 1，3,5 天 mef-/-组细胞培养液的吸光度值均显著高于 mef+/+组。从集落形成实验和 Giemsa 染色实验中也可看出 mef-/-组细胞集落形成率和细胞增殖均高于 mef+/+组。mef-/-组中 MEF 细胞敲除了 JWA基因，故推断 JWA 基因缺失可致细胞过度增殖，而细胞过度增殖可导致肿瘤的发生，同时从细胞衰老实验中还可看出 JWA 基因缺失可致细胞衰老变快，从而可推测 JWA 基因有抗衰老，抗肿瘤作用。JWA 基因是一种环境应答基因，受多种诱导分化剂的调节，与细胞分化和凋亡相关，广泛参与细胞对应激刺激的应答，参与 DNA 损失和修复过程。其基因多态性与多种恶性肿瘤相关，本次试验可以提供一些证据。参考文献1 周建伟，Di PP，Zhao YY，等新的细胞骨架相关基因-JWA 克隆、鉴定、序列分析、表达调节和组织分布研究基因调控探索M北京：军事医学科学出版社，1999:110-119.2 郑峻松，吴 军，罗高兴，et al调节性 T 细胞的 MACS 分选和纯度鉴定J重庆医学，2002，31(8):659-6603 PontouxC，BanzA，PapiernikM. Natural CD4+CD25+ regulatory T cells control the burst of superantigen induced cytokine production: the role of IL-10J. Int Immunol, 2002,14(2):233-239.4 Zeng D, Lan F, Hoffmann P, et alSuppression of graft-verses-hostdisease by naturally occurring regulatory T cellsJ. Thanspl, 2004, 77(1Suppl):S9-S11.5 Louis S, Braudeau C, Giral M, et al. Contrasting CD25+CD4+ T cells/FOXP3 patterns in chronic rejection and operational drug-freetoleranceJ. Thanspl, 2006, 81(3):398-407.6 郑俊松，吴 军，易绍萱，et al. CD4+ CD25+ Treg 细胞调节 T 细胞的作用机制分析J. 第三军医大学学报, 2003; 25(2l):1881-18847 Kingsley CI, Karim M, Bushell AR, et al. CD25+CD4+ regulatory T cells prevent graft rejection: CTLA-4- and IL-10-dependent immuno-regulation of alloresponsesJ. J Immunol, 2002, 168(3):1080-1086.8 Sakaguchi S, Sakaguchi N, Shimizu J, et al. Immunologic tolerance maintained by CD4+CD25+ regulato