枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案

枫叶色素含量的季节性变化测定实验方案 实验原理 枫叶中的色素 当叶子中所含的叶绿素占主导地位时 绿色就 为主色调 抑制了其他色素展现本来面目 入秋后 气温逐渐下降 叶绿素的合成速度受阻 破坏却与日俱增 到后来叶片中只剩下花 青素 类胡萝卜等色素 于是它们便有机会尽情展现自己的如花娇 颜 另外 随着秋季不断降温 尤其是霜降之后 为适应即将到来 的寒冷气候 叶肉内积累了较多的糖分 这些糖分经过复杂的反应 形成了花青素 也由此形成了秋叶变红的重要基础 花青素 花青素是具有 2 苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物 广泛存在于植物中的水溶性天然色素 花青素在自然状态下常与各 种单糖形成糖苷 称为花色苷 溶液 PH 不同 花色苷的存在形式也 不同 对于一个给定的 PH 值 在花色苷的 4 种结构之间存在着平衡 蓝色的醌式 脱水 碱 红色的花烊正离子 无色的甲醇假碱和查 尔酮 花色苷在 PH 值很低时 其溶液呈现最强的红色 随着 PH 值 的增大 花色苷的颜色将褪至无色 最后在高 PH 值时变成紫色或蓝 色 PH 示差法测定花色苷含量的依据是花色苷发色团的结构转换是 PH 的函数 起干扰作用的褐色降解物的特性不随 PH 变化 因此在 花青素最大吸收波长下确定两个对花青苷吸光度差别最大但是对花 色苷稳定的 PH 值 根据 Fuleki T 经验公式 花青素含量 mg 100g TO D avE 1cm W 10 TO D A DV VF A A pH1 0 A pH4 5 其中 DV 稀释体积 VF 稀释倍数 W 样品重量 A 总吸光值 avE 1cm 平均消光系数 代入数值计算 叶绿素 a b 叶绿素是由叶绿酸 叶绿醉和甲醇组成的二醇酷 是四毗咯衍生物 其中的叶琳环是处于二氢形式 中心的金属原子为镁 蔬菜中的叶 绿素有叶绿素 a 和叶绿素 b 两类 叶绿素在植物细胞中与蛋白质结 合成叶绿素蛋白 质 由多种叶绿素蛋白复合物构成叶绿体 当细胞死亡之后 叶绿 素就游离出来 叶绿 素 是 一种不稳定的物质 不耐光 热 酸 不溶于水 易溶于碱 乙醉与乙醚 在碱性溶液中 皂化为叶绿素 碱盐 叶绿素 a b 在长波的最大吸收峰分别在 663nm 645nm 据 Lamber Beer 定律 可得浓度 C 与光密度 D 间的关系式 D663 82 04Ca 9 27Cb D645 16 75Ca 45 6Cb 浓度单位 g mL 叶绿素 a 的浓度 Ca 12 72D663 2 59D645 叶绿素 b 的浓度 Cb 22 88D645 4 68 D663 总叶绿素的浓度 Ct 20 29D645 8 02D663 浓度单位 mg L 材料与用品 枫叶提取液 乙醇 95 AR 盐酸 仪器 PHs 3B 型酸度计 紫外分光光度计 丙酮 石英砂 碳酸钙 分光光度计 天平 剪刀 研钵 移液管 漏斗 大试管 实验步骤 1 1 花青素测定 花青素测定 1 将花青素取液稀释至一定的体积 用稀氢氧化钠和稀盐酸调节 PH 观察提取液在不同 PH 下的颜色变化 对提取液进行 200 800nm 全波长扫描 绘制光谱图 PH1 02 0 原液 4 59 5 溶液颜色 2 测定波长的选择 取枫叶花青素提取液用 5 HCL EtOH 15 85 溶液稀释至一定 体积 进行光谱扫描 确定最大吸收波长 紫外可见吸收光谱 3 PH 示差法中 PH 的选择 在选定 PH 时应考虑以下因素 在此两个 PH 处测定的花青素的 吸收值差异应是最显著的 单一 PH 的轻微变动 对花青素吸光值的 影响是极小的 花青素在所处的两个 PH 下 应是相当稳定的 由于 花青素只有在酸性介质中是稳定的 因此只测定 PH 小于 7 条件下花 青素吸光值的变化 PH 为 1 0 时 花青素以红色的 2 苯基苯并吡喃 的形式存在 PH 为 4 5 时 花青素以无色的甲醇假碱的形式存在 因 此选择 PH 为 1 0 和 4 5 4 平衡时间的确定 因为花青素在溶液介质中存在 4 种结构形式 这 4 种结构形式 在某一 PH 下处于动态平衡 当 PH 改变时 动态平衡发生转移 总 的趋势是 PH 降低时 平衡向红色的 2 苯基苯并吡喃阳离子移动 PH 升高时平衡向蓝色醌式移动 一定时间后达到一个新的平衡 因 此提取液用缓冲液稀释后 必须静置一段时间 等动态平衡处于稳 定后 才能测定吸光值 花青素在缓冲液中的吸光度值与时间的变化关系 nm T min 01020305080110 PH1 0 buffer PH4 5 buffer 结果表明 花青素在缓冲液中的吸光度值随时间变化 在 PH1 0 基 本稳定 在 PH4 5 时 基本稳定 所以综合考虑 选择平衡时间为 5 火棘果花青素含量的测定 移取浓缩液 2ml 用 5 HCL EtOH 稀 释 定容至 100ml 分别移取 10ml 用 PH1 0 和 PH4 5 的缓冲液稀 释至 100ml 平衡 min 在波长 处测定吸光值 根据 Fuleki T 经验公式 花青素含量 mg 100g TO D avE 1cm W 10 TO D A DV VF A A pH1 0 A pH4 5 2 2 叶绿素叶绿素 a ba b 测定 测定 称 1 25g 叶用丙酮研磨 匀浆过滤 用 80 丙酮洗研钵及残渣 合并滤液 滤液用 80 丙酮定容至 25mL 适当稀释后测 A645 A663 1 取样 称取1 25g 剪碎的叶片 提供的样品即为剪碎后冻于 80 的叶片 放入研钵中 注意取样时要避开大的叶脉 2 研磨提取 向研钵中加入80 丙酮2 5ml 以及少许 约0 002g CaCO3 中和酸性 防止叶绿素酯酶分解叶绿素 和石英砂 研磨成 匀浆 再加入3ml 80 丙酮 继续研磨至组织变白 在暗处静止 3 5min 后 用一层干滤纸过滤到25ml 容量瓶中 用滴管吸取80 丙 酮将研钵洗净 清洗液也要过滤到容量瓶中 并用80 丙酮沿滤纸的 周围洗脱色素 待滤纸和残渣全部变白后 用80 丙酮定容至刻度 3 读取吸光度 取厚度为 lcm 的洁净比色皿 注意不要用手接触比 色皿的光面 先用少量色素提取液清洗2 3次 注意清洗时要使清洗 液接触比色皿内壁的所有部分 然后将色素提取液倒入比色皿中 液面高度约为比色皿高度的4 5 将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸 掉 注意不能擦 再用擦镜纸擦干擦净 将比色皿放入仪器的比 色皿架上 注意不要将溶液撒入仪器内 第一个位置放盛有80 丙酮 的比色皿 做为空白对照 将仪器波长分别调至663 645nm 处 以 80 丙酮做为空白对照调透光率100 分别测定溶液在上述2个波长 下的吸光度 每个样品重复测定3次 注意 每次在转换波长时 都 要用80 丙酮调透光率100 结果计算 根据 Fuleki T 经验公式 1 花青素含量 mg 100g TO D avE 1cm W 10 TO D A DV VF A A pH1 0 A pH4 5 其中 DV 稀释体积 VF 稀释倍数 W 样品重量 A 总吸光值 avE 1cm 平均消光系数 代入数值计算 2 D663 82 04Ca 9 27Cb D645 16 75Ca 45 6Cb 浓度单位 g mL 叶绿素 a 的浓度 Ca 12 72D663