梨枯梢病监测与检测技术规程VIP

ICS65.020B 16DB32江苏省地方标准DB 32/ XXXXX2020梨枯梢病监测与检测技术规程Technical specification for monitoring and detection of Shoot Blight of Asian pear2020 - XX - XX发布2020 - XX - XX实施江苏省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：刘凤权、徐会永、赵杨扬、赵延存、孙伟波。12梨枯梢病监测与检测技术规程1 范围本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、砧木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 2292 亚洲梨火疫病监测技术规范SN/T 1157 进出境植物苗木检疫规程SN/T 1193 基因分析检测实验室技术要求3 原理梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌（Erwinia pyrifoliae Kim et al.），是为害梨树的重要细菌病害之一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和分子生物学特征等进行监测与检测。4 试剂与材料检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。5 仪器与用具超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移液器、制冰机等。6 监测技术6.1 监测植物梨，主要监测亚洲梨。6.2 监测区域重点监测亚洲梨集中种植区、引种繁育基地、苗木集散地等疫情发生高风险区。6.3 监测方法6.3.1 苗木监测对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T 1157要求进行抽样，并对样品进行室内检测。6.3.2 田间监测从梨树开花期开始，对当地农技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状（见附录B），如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样，样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信息进行记录（见附录C）。在疫情发生区，选择有代表性的梨园进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7 d调查一次。采用5点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取按照NY/T 2292中的规定执行。7 检测技术7.1 样品处理选择表现典型症状并带有菌脓的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取病健交界处组织约（3 mm5 mm）（3 mm5 mm），表面消毒和清洗后，在装有适量无菌水的离心管中轻轻挤压，浸泡10 min30 min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌脓并用无菌水清洗后制成样品悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。7.2 检测方法7.2.1 显微镜检查对于疑似症状的植物组织，切取病健交界处20 mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下观察有无喷菌现象。7.2.2 培养特征检测将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，28倒置培养24 h72 h。在YPDA培养基平板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征以及质地、水溶性色素等特征，观察并进行记录（参见附录B）。7.2.3 形态特征检测按照常规染色方法，在显微镜下观察细菌菌体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭毛着生的位置和数目、是否产生荚膜和芽胞、芽胞着生的部位和形状、细胞内含物等特征。7.2.4 致病性测定取梨幼果（直径大约3 cm5 cm）洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置于垫有湿润的灭菌滤纸的培养皿中。用无菌接种针蘸取培养24 h36 h的菌落，针刺接种于幼果果肉组织，一个横切面接种3个4个点。接种后26保湿培养，24 h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生和菌脓形成。以无菌水为对照。7.2.5 ELISA检测挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液进行ELISA检测，检测程序参见附录D。如采用商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。7.2.6 PCR检测挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液，1 mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测程序见附录E。如采用市售的试剂盒，按说明操作。检测过程中防污染措施按照SN/T 1193中的规定执行。8 结果判定和报告8.1 结果判定8.1.1 症状识别判定田间梨树发病症状符合附录B描述的梨枯梢病典型症状，判断为梨枯梢病。8.1.2 常规检测结果判定镜检有菌溢现象；分离物形态特征和培养特性与梨枯梢病菌相符（参见附录B）；致病性测定可在接种部位产生高度隆起的乳白色菌脓，最后组织变褐坏死，但不发臭；能再次从接种发病部位分离到目标病原菌，确定病原菌为梨枯梢病菌。8.1.3 ELISA检测结果判定在阴性对照OD值0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品带有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品不带梨枯梢病菌。8.1.4 PCR检测结果判定观察电泳结果，阳性对照在476 bp处有条带出现，且阴性对照无条带，待测样品在476 bp处有条带出现，判断样品中含有梨枯梢病菌；否则判定为阴性反应，即样品中不带梨枯梢病菌。8.2 结果报告8.2.1 监测报告记录监测结果并填写疫情监测记录表（见附录C）。对监测结果进行整理汇总，形成监测报告。8.2.2 检测报告将实验室检测鉴定结果填入植物有害生物样本检测报告（见附录F）。9 样品、菌种保藏和无害化处理9.1 样品保藏未发现梨枯梢病的样品保藏6个月，发现梨枯梢病的样品保藏1年，有贸易纠纷的样品保藏至少1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则应保藏到纠纷解决完毕。保藏样品要标明样品编号、样品名称、保藏人、保藏日期和到期日期。样品保藏期满后，需经灭活销毁处理。9.2 菌种保藏分离得到的梨枯梢病菌菌株应妥善保存，防止扩散。9.3 无害化处理监测和检测过程中使用过的有关材料和用具，在使用完毕后须及时进行灭活销毁处理。10 疫情处置经监测或室内检测发现梨枯梢病，应指导生产、销售和个人实施检疫处治及病害防治。AA附录A （资料性附录）试剂及培养基的配制方法A.1 ELISA检测A.1.1 包被液Na2HCO3 2.93 g、NaCl 1.59 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到9.6，定容至1000 mL。A.1.2 洗涤液Na2HPO412H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g、吐温-20 0.5 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到7.4，定容至1000 mL。A.1.3 样品提取液Na2HPO412H2O 3.58 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.27 g、NaCl 8.01 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到7.4，定容至1000 mL。A.1.4 封闭液脱脂奶粉5 g，溶解于100 mL样品提取液。A.1.5 抗体稀释液脱脂奶粉2.5 g，溶解于100 mL洗涤液。A.1.6 TMB显色液A.1.6.1 底物缓冲液Na2HPO412H2O 2.375 g、柠檬酸 1.1675 g，用蒸馏水溶解，调整pH值到5.0，定容至250 mL。A.1.6.2 TMB母液10 mg TMB溶于1 mL二甲亚砜（DMSO）中，4保存。A.1.6.3 0.75%H2O2取25 L 30% H2O2用超纯水定容到1 mL，4避光保存。A.1.6.4 显色液配置：在10 mL底物缓冲液加入100 L TMB母液和32 L 0.75% H2O2混匀后使用，需要现配现用。A.1.7 终止液浓硫酸 11.1 mL，用蒸馏水定容到100 mL。A.2 PCR检测A.2.1 电泳缓冲液TBETris碱 54 g、硼酸27.5 g、0.5 M EDTA（pH8.0）20 mL，用蒸馏水溶解定容至1000 mL。使用时利用蒸馏水10倍稀释，即为0.5TBE。A.2.2 琼脂糖凝胶在0.5TBE工作液中加入1% (w/v)的琼脂糖，加热融化，冷却至60倒入插入梳子的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。A.2.3 上样缓冲液溴百里酚蓝0.025 g，乙二醇3 g，溶解于10 mL蒸馏水。A.3 YPDA培养基A液：聚蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，溶解于850 mL水中，121湿热灭菌20 min；B液：葡萄糖20 g，溶解于100 mL水中，115湿热灭菌15 min；C液：腺嘌呤硫酸盐20 mg，溶解于10 mL水中，115湿热灭菌15 min；将A、B、C三种溶液混合，用无菌水定容至1000 mL。如制作平板，在A溶液中加入15 g琼脂粉。BB附录B （资料性附录）梨枯梢病基本信息B.1 分类地位梨枯梢病菌（Erwinia pyrifoliae Kim et al.）属于细菌界（Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、肠杆菌目（Enterobacteriales）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae），欧文氏菌属（Erwinia），在亚洲梨（Nashi pear，Pyrus pyrifolia）引起梨枯梢病，为亚洲梨树上的重要检疫性病害。B.2 形态特征革兰氏阴性菌，周生鞭毛，短杆状，兼性厌氧。菌体大小为0.8 m（1.0 m3.0m），以单个、成对或短链形式存在。B.3 生物学特性病菌最适生长温度2527.5。在YPDA培养基上28培养48 h后，菌落大小直径为2 mm，呈圆形、白色、凸起、不透明。B.4 发病规律病原菌在病树上越冬。翌年春天在潮湿环境中，病原菌活跃繁殖，可以通过蜜蜂、蚂蚁等昆虫粘带传播，也可以通过雨水飞溅传播。病原菌通过花器、自然孔口（皮孔、气孔）或伤口侵入，在嫩枝中的胞间或者导管中扩散。B.5 田间症状特征B.5.1 花簇与嫩枝花簇上的症状一般在花瓣脱落1周2周后表现。花器被害后呈萎蔫状，深褐色，并向下蔓延至花柄，使花柄呈水渍状，然后皱缩变成黑褐色，脱落或干枯后仍悬挂在树枝上，花梗上有橘红色菌脓渗出。嫩枝的症状与花期相似，但病害发展更快。嫩枝尖可迅速枯萎形成“牧羊鞭”状。感病叶片常发黑沿中脉扩展至完全坏死。许多患病的嫩芽、梢和树叶，使一棵树看似被烧焦，枯萎。B.5.2 树干与枝条新枝皮色变黑，水渍状，枝尖萎蔫下弯，呈“牧羊鞭”状；多年生枝中部皮层凹陷向前向后蔓延，造成大枝、中心干整枝或整株死亡；枝条、骨干枝和主干表皮流出锈红色液体；拨开皮层韧皮、木质部组织呈黄褐色。B.5.3 叶片沿主脉或沿叶边缘及两脉之间形成黑褐色的病斑。随着变色加深，叶片卷曲萎缩下垂，干枯挂在枝上不脱落，叶柄变黑，叶柄上有桔红色菌浓。B.5.4 果实未成熟的果实受侵染时出现水渍状，然后呈褐色收缩，逐渐变黑，受侵染果实不易脱落。幼果出现黑色斑点、斑块，局部或整个表皮先变黑，后延伸至果肉，果柄通常有菌脓；果实生长期间一直不断随枝发病萎焉皱缩挂在树上失去商品性。CC附录C （规范性附录）疫情监测记录表调查单位： 调查时间：编号作物品种调查地点调查株数疑似症状表现株数监测结果调查人（签字）：DD附录D （资料性附录）梨枯梢病菌双抗ELISA检测程序D.1 包被捕获抗体提前按照市售产品要求用包被液进行稀释，然后每孔加入100 L包被于96孔酶标板上。4孵育12 h16 h后弃去孔中液体，用洗涤液加满每个反应孔，静置1 min2 min后，将洗涤液缓慢倒出，重新加入新的洗涤液，重复上述步骤3次。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.2 封闭酶标板中每孔加入200 L封闭液，37封闭1.5 h后弃去封闭液，用洗涤液洗板3次，每次2 min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.3 加样加入梯度稀释的梨枯梢病菌菌液，每孔100 L。室温孵育1 h后弃去孔中液体，用洗涤液洗板4次，每次2 min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.4 加酶标检测抗体-HRP复合物每孔加入100 L检测抗体-HRP复合物，抗体HRP复合物提前按照市售产品要求进行稀释，置于保湿容器中，25孵育1 h。用洗涤液洗板4次，每次2 min。洗板完成后将酶标板倒置于干净的吸水纸上，吸干反应孔中的水分。D.5 显色提前15 min配好显色液，每孔加入100 L，25避光显色20 min至阳性对照显色。D.6 终止反应显色后在每孔加入50 L终止液。D.7 测定在波长450 nm下用酶标仪测量结果，读取各孔溶液的光密度值（OD值），记录结果。EE附录E （资料性附录）梨枯梢病菌PCR检测程序E.1 DNA提取挑取少量