透射电镜样品制备方法

透射电镜样品制备方法透射电镜样品制备方法 由于电子束穿透能力限制 必须把标本切成厚度小于 0 1um 以 下的薄片才适用 这种薄片称为超薄切片 常用的超薄切片厚度是 50 70nm 在透射电镜的样品制备方法中 超薄切片技术是最基本 最常 用的制备技术 超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似 需要 经过取材 固定 脱水 渗透 包埋聚合 切片及染色等步骤 一 取材的基本要求 组织从生物活体取下后 如果不立即进行适当处理 会由于 细胞内部的各种酶作用 出现细胞自溶现象 此外还可能由于污 染 微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏 因此 为 了细胞结构尽可能保持天然状态 必须做到快 小 准 冷 1 动作迅速 组织从活体取下后应在最短的时间内 争取 1 分钟内 投入 2 5 戊二醛固定液 2 所取组织的体积要小 一般不超过 1mm 1mm 1mm 也可 将组织修成 1mm 1mm 2mm 大小长条形 因为固定剂的 渗透能力较弱 组织块如果太大 块的内部将不能得到良 好的固定 3 机械损伤要小 解剖器械应锋利 操作宜轻 避免牵拉 挫伤与挤压 4 操作最好在低温 0 4 下进行 以降低酶的活性 防 止细胞自溶 5 取材部位要准确 二 取材方法 将取出的组织放在洁净的蜡版上 滴一滴预冷的固定液 用新的 锋利的刀片将组织切下并修小 然后用牙签或者镊子将 组织块移至盛有冷的固定液的 1 5ml 离心管中 如果组织块带有 较多的血液和组织液 应先用 PBS 洗几遍 然后切成小块固定 1 动物及人体组织的取材 在冰浴上进行 动物组织的取材 应麻醉 1 戊巴比铵 5ml kg 体重腹腔 注射 或断头急性处死 解剖出所需器官 用解剖剪刀剪取 一小块组织 放在干净的纸板上 滴一滴冷却的固定液 用 新的 无油污的锋利双面刀片将材料切成大约 1mm 宽 2 3mm 长的小块并从中选出受损伤较小的小条 再将其切成 1mm3的小块 最后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的 新鲜固定液的 1 5ml 管内 放入冰箱冷藏室低温固定 0 4 2 4 小时或以上 固定结束后 将固定液用 PBS 稀释三倍 样品于该溶液 中在 4 冰箱保存 送样前请用 PBS 浸泡清洗 3 次 贴好标 签送至电镜室 2 体外培养细胞的取材 在冰浴上进行 培养在培养瓶中的细胞取材时 先倒出部分培养液 然 后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞 将细胞悬液转移到离心管 中 离心机 4 低速离心 2000 转 分 10 分钟 使细胞聚成 团块 弃去上清 沿壁小心加入新鲜的固定液 保持细胞成 团状态 于 4 冰箱中固定 2 小时以上 固定结束后 将固定液用 PBS 稀释三倍 样品于该溶液 中在 4 冰箱保存 送样前请用 PBS 浸泡清洗 3 次 贴好标 签送至电镜室 对于血液及其他细胞悬浮液 不宜直接固定 可在取材 后将其放入离心管 以 2000 4000 转 分的速度离心 10 15 分 钟 待样品在离心管底部集结成团块状后 用吸管吸出上清 液 再缓缓滴入固定液稍加固定 然后用刮铲将样品取出并 切割成小块 再行固定 3 植物组织取材 植物组织的取材比较容易 它的细胞离体后变化不像动 物细胞那么迅速 但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速 渗透 因此 植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状 经适 当的固定后再切成小方块 固定结束后 将固定液用 PBS 稀释三倍 样品于该溶液 中在 4 冰箱保存 送样前请用 PBS 浸泡清洗 3 次 贴好标 签送至电镜室 4 细菌及藻类等样品取材 对于不易成团的样品 需先清洗 加入固定液后吹散 于 4 冰箱中固定 2 小时 固定结束后 PBS 清洗 3 次 继 续按照文献 琼脂铸模法制备透射电镜样品 白焕红 内描 述方法进行琼脂预固定 再将琼脂预包埋后的样品于 4 冰 箱中固定过夜 固定结束后 将固定液用 PBS 稀释三倍 样品于该溶 液中在 4 冰箱保存 送样前请用 PBS 浸泡清洗 3 次 贴好 标签送至电镜室 缓冲液配方缓冲液配方 磷酸盐缓冲液 三个步骤 磷酸盐缓冲液 三个步骤 1 磷酸盐缓冲液 0 2M 甲液甲液 0 2M 的磷酸氢二钠溶液乙液乙液 0 2M 的磷酸二氢钠溶液 Na2HPO42H2O 35 61g Na2HPO47H2O 53 65g Na2HPO412H2O 71 64g NaH2PO4H2O 27 60g NaH2PO42H2O 31 21g 加蒸馏水溶解成 1000ml加蒸馏水溶解成 1000ml 2 按下表混合甲 乙两液既得所需 pH 的 0 2M 缓冲液 0 2M 磷酸盐缓冲液的配制磷酸盐缓冲液的配制 3 将溶液用蒸馏水 1 1 稀释 则配得 0 1M 的缓冲液 pH6 46 66 87 07 27 47 67