酵母菌的分离与纯化

酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营 是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源 不同图样中各 类微生物的含量不同 一般土壤中细菌数量最多 其次为放线菌和霉菌 放线菌一般在较 干燥 偏碱性 有机质较多的土壤中较多 霉菌在含有机质丰富 偏酸性 通气性较好的 土壤中较多 酵母菌在一般土壤中的数量较少 而在酒曲 面肥 水果表皮 果园土壤中 数量多些 一 菌源 1 土样 用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下 1 10cm 土壤 10g 装入灭菌的牛皮 纸袋内 封好袋口 记录取样地点 环境及日期 图样采集后应及时分离 饭不能立即分 离的样品 应保存在低温 干燥的条件下 以减少其中菌相的变化 2 面肥 1 面粉 500 克 白酒 100 克 水 250 和好静置发酵就可以了 冬季10 个小时 2 在温水中兑一点酒 倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器 陶瓷 砂锅 中 用布将整个盛器盖好置于温度较高处 6 小时后即成面肥 以上方法做出的面肥只能保存几天 不宜放置太久 3 水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌 既可单独作为菌源也可以和果园土壤作 为混合菌源 二 酵母菌的分离 1 制备菌悬液 称取菌源 1g 加入盛有 99ml 无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中 振荡 20min 即成 10 2的菌源悬液 再一次稀释成 10 4 10 5 10 6三个稀释度 2 涂布法分离 取融化并冷却至 45 50 度左右的豆芽汁葡萄糖培养基 每皿分别倾注约12ml 培养基 到培养皿内 注意 温度过高易将菌烫死 皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果 低于 45 度培养基易凝固 平板高低不平 呆平板冷却后 用无菌移液管分别吸取上述已经 制好的菌源稀释液 10 4 10 5 10 6三个稀释度菌悬液各 0 1ml 依次滴加于相应编号 的豆芽汁葡萄糖培养基平板上 每个稀释度做2 3 个平行皿 左手拿培养皿 并用拇 指将皿盖打开一缝 再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩 散 注意 切忌用力过猛 这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破 3 培养 接种后 平版倒置于 30 度恒温箱中 培养 2 3 天 观察结果 4 纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落 在平板上四区划线 培养后分离得到单个菌落 酵母扩培方案酵母扩培方案 一 培养基制备一 培养基制备 一一 麦芽汁培养基的配制麦芽汁培养基的配制 1 培养基成分 新鲜麦芽汁一般为 10 15 波林 2 配制方法 1 用水将大麦或小麦洗净 用水浸泡 6 12h 置于 15 阴凉处发芽 上盖 纱布 每日早 中 晚淋水一次 待麦芽伸长至麦粒的两倍时 让其停止发芽 晒干或烘干 研磨成麦芽粉 贮存备用 2 取一份麦芽粉加四份水 在 65 水浴锅中保温 3 4h 使其自行糖化 直至糖化完全 检查方法是取 0 5ml 的糖化液 加 2 滴碘液 如无蓝色出现 即 表示糖化完全 3 糖化液用 4 6 层纱布过滤 滤液如仍混浊 可用鸡蛋清澄清 用一个鸡 蛋清 加水 20 m1 调匀至生泡沫 倒入糖化液中 搅拌煮沸 再过滤 4 用波美比重计检测糖化液中糖浓度 将滤液用水稀释到 10 15 波林 调 pH 至 6 4 如当地有啤酒厂 可用未经发酵 未加酒花的新鲜麦芽汁 加水稀 释到 10 15 波林后使用 5 如配固体麦芽汁培养基时 加入 2 琼脂 加热融化 补充失水 6 分装 加塞 包扎 7 高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min 二 二 马铃薯葡萄糖培养基的配制马铃薯葡萄糖培养基的配制 1 培养基成分 马铃薯 20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1 5 2g 水 100ml 自然 pH 2 配制方法 1 配制 20 马铃薯浸汁 取去皮马铃薯 200g 切成小块 加水 1000m1 80 浸泡 lh 用纱布过滤 然后补足失水至所需体积 100 Pa 灭菌 20 min 即成 20 马铃薯浸汁 贮存备用 2 配制时 按每 100 m1 马铃薯浸汁加入 2g 葡萄糖 加热煮沸后加入 2g 琼脂 继续加热融化并补足失水 3 分装 加塞 包扎 4 高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min 三三 豆芽汁葡萄糟培养基的配制豆芽汁葡萄糟培养基的配制 1 培养基成分 黄豆芽 10g 葡萄糖 5g 琼脂 1 5 2g 水 100ml 自然 pH 2 配制方法 1 称新鲜黄豆芽 10g 置于烧杯中 再加入 100 m1 水 小火煮沸 30 min 用 纱布过滤 补足失水 即制成 10 豆芽汁 2 配制时 按每 100 m1 10 豆芽汁加入 5g 葡萄糖 煮沸后加入 2 g 琼脂 继续加热融化 补足失水 3 分装 加塞 包扎 4 高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min 四四 察氏察氏 czapck czapck 培养基的配制培养基的配制 1 培养基成分 蔗糖 3g NaN03 0 3g K2HP04 0 1g KCl 0 05g MgSO4 7H2O 0 05 g FeS04 0 001 g 琼脂 1 5 2g 蒸馏水 100ml 自然 pH 2 配制方法 1 称量及溶化 量取所需水量约 2 3 左右加入到烧杯中 分别称取蔗糖 NaNO3 K2HP04 KCl MgSO4 依次逐一加入水中溶解 按每 100 ml 培养基 加入 1ml 0 1 的 FeS04 溶液 2 定容 候药品全部溶解后 将溶液倒入量筒中 加水至所需体积 3 加琼脂 加入所需量琼脂 加热融化 补足失水 4 分装 加塞 包扎 5 高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min YPDYPD 培养基培养基 YPD 或 YPED Yeast Extract Peptone Dextrose Medium 1L 又叫酵母浸 出粉胨葡萄糖培养基 加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖 YPD 琼脂培养基 用于酵母菌的培养 配方 1 Yeast Extract 酵母膏 2 Peptone 蛋白胨 2 Dextrose glucose 葡萄糖 若制固体培养基 加入 2 琼脂粉 配制方法 1 溶解 10gYeast Extract 酵母膏 20gPeptone 蛋白胨 于 900ml 水中 如制平板加入 20g 琼脂粉 2 高压 121 度 20min 3 加入 100ml 10 Dextrose glucose 葡萄糖 葡糖糖溶液灭菌后加入 注 葡萄糖 yeast extract peptone 溶液混合后在高温下可能会发生化学 反应 导致培养基成分变化 所以要分别灭菌后再混合 YPEG 除了用 3 乙醇和 3 甘油代替葡萄糖作为碳源外 其他成分同 YPD 二 接种操作二 接种操作 器具 酒精灯 酒精棉 剪刀 接种针 镊子 定量移液器或吸管等 仪器 超净工作台等 方法 无菌室使用前 使用紫外线灯照射 20 30 分钟进行杀菌 进入无菌室换无菌工 作服 所有操作采用无菌操作 活化 操作前将冷冻管菌种置于室温下 使之内部培养基达到室温后 振荡均匀 无菌操作 将冷冻管内的培养液全部转入盛有 5mL 培养基的试管中 于 25 1 培养 72 2 小时 将试管中的培养液轻轻振荡均匀 用接种环接取三环加入另一支盛有 5mL 培 养基的试管中 于 25 1 培养 24 36 小时 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀 用无菌吸管接 0 1mL 加入盛有 10mL 培养基的试管 振荡均匀后于 25 1 培养 24 36 小时 扩大 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀后 全部接入小巴氏瓶 三角瓶 每 个小巴氏瓶 三角瓶 接入一支试管的培养液 然后于 23 1 培养 24 36 小 时 将培养结束的小巴氏瓶 三角瓶 轻轻振荡均匀后 全部接入大巴氏瓶 大 三角瓶 每个大巴氏瓶 大三角瓶 接入一只小巴氏瓶 三角瓶 的培养液 然后于 21 1 培养 24 36 小时 将培养结束的大巴氏瓶 大三角瓶 轻轻振荡均匀后 全部接入卡氏罐 每 个卡氏罐接入两只大巴氏瓶 大三角瓶 的培养液 然后于 18 1 培养 24 36 小时 注 除卡氏罐外 其它液体培养基在接种后每 12 小时应振摇一次 以去除 二氧化碳 保证酵