cellculture

细胞培养实验技能基本知识,基本概念,细胞培养技术 细胞系细胞株原代培养传代,细胞培养(cell culture)技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用的重要技术。,细胞系,培养物开始第一次传代培养后的细胞有限细胞系（Finite Cell Line）连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞株,用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,细胞系或细胞株的命名,以供体患者的姓名命名： HeLa （来源于宫颈癌）以时间地点来命名： CHO 中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese Hamster Ovary， ）宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立 每3天传代，每次接种3105细胞ml以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞) 以临床疾病类型命名：如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞),原代培养,直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,大鼠肝细胞原代培养1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养； 细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁 后呈不规则。,传代,将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。,HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养2天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。,传代注意事项,接种数量为51048105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,细胞培养的基本条件,无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保存条件实验室安全,细胞培养的无菌环境,无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 （使用前）紫外照射（1小时）每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒,生物安全柜,使用前开启柜内紫外灯照射1030分钟，预工作1015分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。还要定期用福尔马林熏蒸。,常用培养器皿及清洗消毒,玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。,消毒前包装,常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔,火焰消毒,在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶 25平方厘米，正方斜颈25平方厘米，三角斜颈75平方厘米，正方斜颈75平方厘米，三角斜颈150平方厘米，正方斜颈,细胞培养板6孔，12孔，24孔，48孔96孔,细胞培养皿35mm60mm100mm,冻存管1.2ml 2ml，5ml,离心管15ml50ml细胞刮,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。,液氮罐,何处购买细胞,ATCC 细胞库().美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB),国内细胞库,中国科学院细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法：地址：上海市岳阳路320号，200031电话 54920405Fax:系人：陈松华，徐惠均e-mail: ,/cctcc/fzlbc/pywml.htm中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料菌种保藏机构,订购程序,向中心订购培养物，可查阅CCTCC培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话传真E-mail:细胞系：300500元/每株 菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。,细胞的营养,碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素,细胞培养液,水平衡盐溶液 pH调节液消化液抗生素溶液培养基,水：新鲜配置的三蒸水或去离子水,细胞培养用液的配制,平衡盐溶液,主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用 维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液 生理盐水 PBS Hanks /p-43418894.html （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）,pH调节液(1) 碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂通常使用浓度为1015mM,消化液胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 (3)胶原酶溶液 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。,抗生素溶液通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位,培养基,分天然培养基和合成培养基天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）,合成培养基,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、另有无血清培养基、无蛋白培养基,RPMI1640,最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、 K-562 及KATOIII等细胞系的培养。,RPMI1640种类,RPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌）RPMI1640（A）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌）RPMI1640 （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）,DMEM细胞培养基,是在MEM培养基的基础上研制的与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。,干粉培养基的配制,认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 所用器皿应严格消毒。 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。,血清的使用,血清质量好坏是实验成败的关键常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。血清的消毒 过滤除菌。,牛血清,胎牛血清应取自剖腹产的胎牛新牛血清取自出生24小时之内的新生牛小牛血清取自出生1030天的小牛使用浓度： 一般为520，最常用是10,何谓FBS、FCS、 CS、HS ?,FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清HS (horse serum) 则是指马血清,血清解冻步骤,逐步解冻法 20 或70 至4 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装4045 ml。勿直接由20 至37 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。,无机盐,CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。,氨基酸,缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺 。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性 。,体外培养细胞的分型,贴附型,大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：成纤维细胞上皮型细胞游走细胞型多型细胞型,1、成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等 的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞,HUVECs人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：4d；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：DMEM+15胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：7天；3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；4.培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。,2、上皮型细胞,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,SKOv3 （卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。,CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。,3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,CNE11.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系；2.培养的天数：3d；3.放大倍速：相差100；4.培养基种类：PMI1640+10%CS；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞， 梭型成团生长。,4、多型细胞型,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,SD大鼠神经元 原代1.细胞种类：脑皮质细胞；2.培养的天数：4-5天；3.放大倍速：电镜20000；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10%马 血清；5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴 突和树突。,悬浮型,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),HL-60 分化细胞Giemsa染色1. 细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：ATRA 1微摩尔作用5天；3. 放大倍速：倒置显微镜 X10；4. 培养基种类：1640+8胎牛血清；5. 细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。,KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。,K562细胞1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,每代贴壁细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,细胞传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 首次传代时细胞接种数量要多一些 首次传代培养的pH应偏低些 小牛血清浓度可加大至15%20%左右,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml4大格细胞总数/ 4104注意：压线细胞只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,培养细胞活力测定,细胞活力： 总细胞中活细胞所占的百分比由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,测定方法,台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。,3四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢 （formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定OD值；,细胞冻存和复苏,细胞深低温保存的基本原理是： 在70以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键： 在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,慢冻程序 4 10 分钟 20 30 分钟 80 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。也有用甘油的冻存液： 含20%血清培养基 10% DMSO（或10甘油） DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多