免疫学--ELISA原理

ELISAELISA 原理原理 操作规则 新手适用 操作规则 新手适用 点击次数 3347 发布时间 2010 7 12 8 45 33 ELISA 原理 操作规则 新手适用 酶联免疫吸附实验 ELISA 一 实验目的 酶联免疫吸附测定 enzyme linked immunosorbent assay 简称 ELISA 是在免疫酶技术 immunoenzymatic techniques 的基础上发展起来的一种新 型的免疫测定技术 ELISA 过程包括抗原 抗体 吸附在固相载体上称为包被 加待测抗体 抗原 再加相应酶标记抗体 抗原 生成抗原 抗体 待 测抗体 抗原 酶标记抗体的复合物 再与该酶的底物反应生成有色产物 借助分光光度计的光吸收计算抗体 抗原 的量 待测抗体 抗原 的定量与 有色产生成正比 二 实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多 如过氧化物酶 碱性磷酸酯酶 半 乳糖苷酶 葡萄糖氧化酶 碳酸酐酶 乙酰胆碱酯酶 6 磷酸葡萄糖脱氧酶等 常用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶 碱性磷酸酯酶等 其中尤以辣根过氧 化物酶为多 由于酶摧化的是氧化还原反应 在呈色后须立刻测定 否则空气 中的氧化作用使颜色加深 无法准确地定量 辣根过氧化物酶 HRP 是一种糖蛋白 每个分子含有一个氯化血红素 protonhemin 区作辅基 酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示 氯化血红素 辅基的最大吸收峰是 403nm HRP 酶蛋白的最大吸收峰是 275nm 所以酶的浓度 和纯度计算式是 已知 HRP 的 A 1cm 403nm 1 25 式中 1 指 HRP 百分浓 度为 100ml 含酶蛋白 1g 即 10mg ml 所以 酶浓度以 mg ml 计算是 HRP 的 A 1cm 403nm mg ml 2 5 HRP 纯度 RZ A403nm A275nm 纯度 RZ einheit Zahl 值越大说明酶内所含杂质越少 高纯度 HRP 的 RZ 值在 3 0 左右 最高可达 3 4 用于 ELISA 检测的 HRP 的 RZ 值要求在 3 0 以上 ELISA 的基本原理有三条 1 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面 可能是蛋白和聚苯乙 烯表面间的疏水性部分相互吸附 并保持其免疫学活性 2 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物 而此种酶结合物仍 能保持其免疫学和酶学活性 3 酶结合物与相应抗原或抗体结合后 可根据加入底物的颜色反应来判 定是否有免疫反应的存在 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的 量成正比例的 因此 可以按底物显色的程度显示试验结果 ELISA 法是免疫诊断中的一项新技术 现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病 寄生虫病及 非传染病等方面的免疫诊断 也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定 根据已经使用的结果 认 为 ELISA 法具有灵敏 特异 简单 快速 稳定及易于自动化操作等特点 不仅适用于临床标本的检查 而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本 因此 也适合于血清流行病学调查 本法不仅可以用来 测定抗体 而且也可用于测定体液中的循环抗原 所以也是一种早期诊断的良好方法 因此 ELISA 法在 生物医学各领域的应用范围日益扩大 可概括四个方面 1 免疫酶染色各种细胞内成份的定位 2 研 究抗酶抗体的合成 3 显现微量的免疫沉淀反应 4 定量检测体液中抗原或抗体成份 基本方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法 1 包被 用 0 05M PH9 牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1 10 g ml 在每个聚 苯乙烯板的反应孔中加 0 1ml 4 过夜 次日 弃去孔内溶液 用洗涤缓冲液洗 3 次 每次 3 分钟 简 称洗涤 下同 2 加样 加一定稀释的待检样品 0 1ml 于上述已包被之反应孔中 置 37 孵育 1 小时 然后洗涤 同时做空白孔 阴性对照孔及阳性对照孔 3 加酶标抗体 于各反应孔中 加入新鲜稀释的酶标抗体 经滴定后的稀释度 0 1ml 37 孵育 0 5 1 小时 洗涤 4 加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0 1ml 37 10 30 分钟 5 终止反应 于各反应孔中加入 2M 硫酸 0 05ml 6 结果判定 可于白色背景上 直接用肉眼观察结果 反应孔内颜色越深 阳性程度越强 阴性反 应为无色或极浅 依据所呈颜色的深浅 以 号表示 也可测 O D 值 在 ELISA 检测仪上 于 450nm 若以 ABTS 显色 则 410nm 处 以空白对照孔调零后测各孔 O D 值 若大于规定的阴性对 照 OD 值的 2 1 倍 即为阳性 基本方法二 用于检测未知抗体的间接法 用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1 10 g ml 每孔加 0 1ml 4 过夜 次日洗涤 3 次 加一定稀释的待检样品 未知抗体 0 1ml 于上述已包被之反应孔中 置 37 孵育 1 小时 洗涤 同时做 空白 阴性及阳性孔对照 于反应孔中 加入新鲜稀释的酶标第二抗体 抗抗体 0 1ml 37 孵育 30 60 分钟 洗涤 最后一遍用 DDW 洗涤 其余步骤同 双抗体夹心法 的 4 5 6 二 酶与底物 酶结合物是酶与抗体或抗原 半抗原在交联剂作用下联结的产物 是 ELISA 成败的关键试剂 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应 还具有酶促反 应 显示出生物放大作用 但不同的酶选用不同的底物 免疫技术常用的酶及其底物 酶酶底物底物显色反应显色反应测定波长测定波长 邻苯二胺橘红色 492 四甲替联苯胺黄色 460 氨基水杨酸棕色 449 邻联苯甲胺兰色 425 辣根过氧化物酶 2 2 连胺基 2 3 乙基 并噻唑啉磺酸 6 铵盐 蓝绿色 642 碱性磷酸酯酶4 硝基酚磷酸盐 PNP 黄色 400 萘酚 AS Mx 磷酸盐 重氮 盐 红色 500 ABTS HRP 葡萄糖黄色 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 甲硫酚嗪 噻唑兰深蓝色 405 420 甲基伞酮基半乳糖苷 4MuG 荧光 360 450 半乳糖苷酶 硝基酚半乳糖苷 ONPG 黄色 420 终止剂为 2mol L H2SO4 终止剂为 2 mol L 柠檬酸 不同的底物有不同的终止剂 可催化下列反应 HRP H2O2 复合物 复合物 AH2 过氧化物酶 H2O A AH2 为无色底物 供氢体 A 为有色产物 三 ELISA 常用的四种方法 1 直接法直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面 加酶标抗体 形成抗原 抗体复合物 加底物 底物的降解量 抗原量 2 间接法间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面 加抗体 形成抗原 抗体复合物 加酶标抗体 加底物 测定底物的降解量 抗体量 3 双抗体夹心法双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面 加抗原 形成抗原 抗体复合物 加抗原免疫第二种动物获得的抗体 形成抗体抗原抗体复合物 加酶标抗抗体 第二种动物抗体的抗体 加底物 底物的降解量 抗原量 4 竞争法竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面 1 加入酶标抗原 2 3 加入酶标抗原和待测抗原 加底物 对照孔与样品孔底物降解量的差 未知抗原量 三 仪器和材料 1 聚苯乙烯微量细胞培养板 平板 40 96 孔 2 酶联免疫检测仪 3 辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG 工作稀释度 1 1000 4 包被液 0 05mol L pH9 6 碳酸缓冲液 4 保存 Na2CO3 0 15 克 NaHCO3 0 293 克 蒸馏水稀释至 100 ml 5 稀释液 0 01mol LpH7 4 PBS Tween 20 保存 NaCl 8g KH2PO4 0 2g Na2HPO4 12H2O 2 9g Tween 20 0 5ml 蒸馏水加至 1000ml 6 洗涤液 同稀释液 7 封闭液 0 5 鸡卵清蛋白 pH7 4 PBS 8 邻苯二胺溶液 底物 临用前配制 0 1M 柠檬酸 2 1g 100ml 6 1ml 0 2M Na2HPO4 12H2O 7 163g 100ml 6 4ml 蒸馏水 12 5ml 邻 苯二胺 10mg 溶解后 临用前加 30 H2O2 40 微升 9 终止液 2mol LH2SO4 四 操作步骤 1 包被抗原 用包被液将抗原作适当稀释 一般为 1 10 微克 孔 每孔 加 200 微升 37 温育 1 小时后 4 冰箱放置 16 18 小时 2 洗涤 倒尽板孔中液体 加满洗涤液 静放三分钟 反复三次 最后将 反应板倒置在吸水纸上 使孔中洗涤液流尽 3 加封闭液 200 微升 37 放置一小时 4 洗涤同 2