常见PCR方法整理

PCR 的一般流程的一般流程 以 以 Taq DNA 聚合酶为例 聚合酶为例 一 一 试剂和仪器试剂和仪器 1 仪器 PCR 仪 移液器 离心管和枪头 121 灭菌 20min 烘干 冰盒 板架 离心机 2 ddH2O 三蒸水 121 灭菌 20min 4 保存 3 Buffer 含 Mg2 10 20 保存 4 dNTP 保存液为 25mM 使用前用 ddH2O 稀释为 2 5mM 并分装 避免污染 20 保存 5 引物 引物干粉在溶解前先 12 000rpm 离心 2min 再用 ddH2O 溶解至 10 M 涡 旋震荡使其充分溶解 20 保存 6 模板 7 Taq DNA 聚合酶 20 保存 二 二 实验准备实验准备 1 预订 PCR 仪 填写好使用时间 2 制冰 3 将所需试剂解冻 混匀 瞬离 置于冰上 模板要放在冰上解冻 三 三 步骤 步骤 1 设计实验 认真阅读相关试剂说明书 2 将离心管置于冰上 按照如下体系加入样品 加样顺序为 ddH2O Buffer dNTP 引物 模板 Taq DNA 聚合酶反应体系 25 L 试剂用量 L ddH2O18 375 L Buffer Mg2 10 2 5 L dNTP 2 5mM 2 L 引物 正向和反向 10 M 各 0 5 L 模板 DNA102 105copies Taq DNA 聚合酶 0 125 L 注意 加酶之前将酶拿出放冰上 使用完立即放回冰箱 3 在离心管盖上写好每个样品的编号 瞬离 4 设置好 PCR 程序 待反应温度达到实验需要时 将样品放入 PCR 仪 尽量放在中 央的孔 5 将试剂放回原处 移液器调回最大量程 整理实验台 6 反应结束后 及时停止 PCR 程序 不要停在 4 太久 取出样品 关好 PCR 仪 四 四 其它注意事项 其它注意事项 1 正确使用移液器 离心机和 PCR 仪 2 手或移液器不要接触反应管或试剂瓶 管的内壁 盖内侧 3 不使用枪头时 盖好枪头盒盖 4 枪头只能使用一次 5 合理设计实验 使用适当的阴性对照很重要 如 使用不加 DNA 的材料进行 PCR 扩增 以证明缓冲液或其他试剂中是否存在任何可影响 PCR 的污染物 6 如果一次实验需做多管样品 尽量先配制 mix 由于存在液体混合后的体积变化和 挂液 计算 mix 用量要比实际管数多一些 7 反应在 PCR 仪进行期间 最好能检查一下程序是否在正常运行 及时发现异常 3 2 移液器的使用方法移液器的使用方法 1 调节量程 轻轻旋转量程调节圈 注意不要超过量程 建议从高到低调节量程 必要时 可旋转量程调节圈稍超过所需数值 再向回旋转 移液可以更准确 2 装配枪头 轻轻按压 将枪头盒上的枪头装配到移液器 3 吸液 按下操作键至一档 设定体积 将枪头垂直浸入液体约 4mm 让操作键慢慢复 位 此过程中保持枪头浸入深度 防止吸入空气 将枪头慢慢移出液面 并确保枪头外 壁无残留液体 建议每个新枪头先经过一到三次的吸液和放液来润湿 有助于提高移 液准确度 吸取大体积液体时 将枪头保持浸入状态约 3 秒钟 再移液 A B 图 3 2 1 移液器的吸液 A 和放液 B 4 放液 将枪头倾斜地紧贴管壁 将操作键慢慢按向一档 设定体积 等待 直到不再 有液体流出 将操作键按向二档 吹液 将枪头完全排空 仍然按住操作键 在管壁 上擦拭枪头 在管外 慢慢让操作键复位 按下脱卸键卸掉枪头 5 其它注意事项 1 轻拿轻放 使用后调回最大量程 2 保持移液器洁净 3 与水有很大物理性差异的溶液 或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液 可能 会导致移液不准 要注意检查移液体积 3 3 PCR 反应原理及过程反应原理及过程 3 3 1 反应原理反应原理 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程 其特异性依赖于与靶序列两端互 补的寡核苷酸引物 是利用 DNA 在体外摄氏 95 高温时变性会变成单链 低温 经常是 60 C 左右 时引物与单链按碱基互补配对的原则结合 再调温度至 DNA 聚合酶最适反应 温度 72 C 左右 DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖 5 3 的方向合成互补链 图 3 3 1 基于聚合酶制造的 PCR 仪实际就是一个温控设备 能在变性温度 复性温度 延伸温度之 间很好地进行控制 3 5 2 反应过程反应过程 PCR 由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 图 3 3 2 模板 DNA 的变性 模 板 DNA 经加热至 95 左右一定时间后 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板 DNA 与引物的退 火 复性 模板 DNA 经加热变性成单链后 温度降至 55 左右 引物与模板 DNA 单 链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA 模板 引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作 用下 以 dNTP 为反应原料 靶序列为模板 按碱基互补配对与半保留复制原理 合成一 条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性 退火 延伸三过程就可获得更 多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 每完成一个循环需 2 4 分 钟 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 图 3 3 1 PCR 反应原理 图 3 3 2 PCR 的基本步骤 3 4 几种常用几种常用 PCR 方法方法 3 4 1 标准标准 PCR Standard PCR 该方法适用于扩增小于 3000bp 的 DNA 序列 建议体系 Reaction Volume100 L Taq Polymerase2 2 5U Primers0 1 1 0 M each dNTP0 2mM each Salt6 50mM KCl or NH4 2SO4 Mg2 1 5 5 0mM MgCl2 or MgSO4 BufferTris HCl 10 50mM pH 7 5 9 0 Template102 105copies 3 4 2 长范围长范围 PCR Long and Accurate PCR LA PCR 使用混合的聚合酶 含有一种能校对的聚合酶 能够增加可扩增产物的大小 5kb 40kb 因为能去掉错误掺入的核苷酸 而不引起链的终止 Reaction Volume33 L Polymerase Klentaq1 a plus 1 16 Pfu or 1 50 Deep Vent by volume 1 160 or 1 500 by units Salt16mM NH4 2SO4 no KCl Mg2 3 5mM MgCl2 pH9 2 Buffer50mM Tris Template2ng lambda DNA Cycles20 Extension Temp68 Extension Time11 24min longer at later cycles 3 4 3 热启动热启动 PCR Hot Start PCR 热启动 PCR 是提高产量和特异性的一种简单方法 但也可能会造成重复性和污染等问 题 室温下加样 可能会导致引物和模板的非特异性结合 在 PCR 的最初几个循环里 通 过变性可以防止这些非特异性结合产物的延伸 热启动 PCR 则通过控制一种 PCR 成分的 加样时间 来提高扩增的特异性 通常 直到反应温度到达引物最适退火温度以上时 再 加入这种关键成分 如引物 酶 Mg2 或 dNTP 热启动温度随推迟反应的方式而改变 推迟 PCR 反应有几种方式 最简单的一种是 在反应管达到第一个循环的 DNA 熔解 温度之前 不要将 DNA 聚合酶加到反应管内 当处理少量样品时 这种方法可以得到令 人满意的效果 但当处理大量样品时 则效果不佳 一种更方便的方法是 使一种组分在 达到一个适当的温度之前处于无效状态 例如 把聚合酶或镁盐掺入到蜡珠内便可做到这 一点 这些珠子在适当的温度熔化 能够使反应开始 另一种方法是 在开始时 用一种 抗体与聚合酶形成复合物 使聚合酶灭活 在高温下抗体变性 能够使聚合酶发挥功能 如果在热启动 PCR 中使用修饰过的酶 则需要向典型的 PCR 反应中加一预热步骤 预热 温度可以在 92 100 之间 时间为 2 20 分钟 有助于消除在较低温度时引物和模板结合形 成的非特异产物 热启动 PCR 可以与其它 PCR 方法 如 touchdown PCR 结合使用 3 4 4 温度递降温度递降 PCR Touchdown PCR Touchdown PCR 最初用来简化确定最适退火温度的过程 最初使用一个高的退火温度 在此温度下 即使正确的结合可能也无法进行 在随后几轮 降低退火温度 当降到某 一个温度点时 只有正确匹配的引物 模板能够退火 而不正确的匹配则不能够退火 因此 DNA 合成能够开始 尽管后来的循环可能会在不是最严谨的条件下进行 但早期的循环已 在最严谨的条件下进行 想要的目标产物将是最丰富的 通常 第一个循环的退火温度设 置为高于理论 Tm 15 在接下来的循环里 每循环降低 1 2 直到低于 Tm 5 左右 3 4 5 嵌套嵌套 PCR 巢式 巢式 PCR Nested PCR 在这种 PCR 中 进行两次连续的 PCR 第一次 PCR 使用常规的模板 然后用第一次 PCR 反应的产物 通常要稀释适当倍数 作为第二次 PCR 的模板 将第二次 PCR 的引物 设计成能够与第一次 PCR 目标产物的序列退火 虽然第一次 PCR 除了能产生目标产物外 可能还会产生一些非特异性的产物 但非特异性的产物几乎不可能也包含第二次 PCR 所用 引物的两个位点 因此 只有第一次 PCR 的目标产物才可能是第二次 PCR 的合适模板 3 5 PCR 可变因素可变因素 PCR 的各种因素相互影响 相互制约 很难同时提高 PCR 的特异性 产量和保真度 3 5 1 引物 引物 Primers 标准用量 0 1 1 0 M 多数情况下 0 2 0 5 M 就能满足需要 提高特异性 1 降低引物和 dNTP 的浓度可以显著提高特异性 高浓度会导致非特异 结合 引物二聚体的形成 2 在适当范围内 降低引物 模板的比例 提高产量 提高引物 模板的比例 如果有过剩的引物 需要降低引物浓度 3 5 2 聚合酶 聚合酶 Polymerases 标准用量 1 5Units L 不同供货商对 Unit 的定义会有差别 提高特异性 在适当范围内 降低聚合酶浓度 聚合酶浓度是决定 PCR 严格度的一个 关键因素 高浓度的聚合酶不仅会降低特异性 还会造成不必要的浪费 提高保真度 使用高保真聚合酶 3 5 3 模板 模板 Templates 标准用量 102 105个拷贝 反应中的模板量应当用目的序列的拷贝数来衡量 一般 降低 DNA 模板浓度 也应 该降低聚合酶浓度 在合适范围内 提高特异性 1 增加模板量 2 降低引物 模板的比例 提高产量 1 增加引物 模板比例 2 扩增较小片段的模板 DNA 更易获得较高产 量 3 5 4 dNTP Deoxynucleoside Triphosphates 标准用量 20 200 M 四种 dNTP 的浓度应当相同 并且要高于每种 dNTP 的估算 Km 10 M 15 M 提高特异性 降低 dNTP 浓度 需要注意的是 Mg2 的浓度也要等摩尔比例地降低 提高产量 对于较长的模板序列 要适当增加 dNTP 提高保真度 降低 dNTP 浓度 3 5 5 镁离子 镁离子 Magnesium ions Mg2 浓度应当比总 dNTP 浓度多 0 5 3 0mM 提高特异性 降低浓度 注意如果 Mg2 浓度不正确会降低产量 提高产量 提高浓度 然而 Mg2 浓度过高易导致非特异性结合和电泳 smear 3 5 6 预温育的温度和时间 预温育的温度和时间 Preincubation Temperatures and Times 标准范围 92 96 30sec 10min 预温育能降低样品中有害蛋白酶和核酸酶的活性 还能保证基因组 DNA 中复杂模板 完全变性 3 5 7 解链温度和时间 解链温度和时间 Melting Temperatures and Times 标准范围 68 75 30 120sec 通常将加热变性使 50 的双链 DNA 解链的温度称为 DNA 的解链温度或熔解温度 用 Tm表示 影响解链温度的因素是样品的总质量和浓度 有一些方法可以计算解链温度 但只是 估计 实验所需的最优温度还需要结合经验来尝试 时间方面则需要考虑 PCR 仪的升温降温过程 以及 PCR 仪是根据样品温度来计算时 间 还是仅根据仪器孔的温度来计算时间 对于20bp 的引物 Tm 62 3 0 41 G C 500 length 3 5 8 退火 退火 Annealing Hybridization 标准范围 37 65 一般是比 Tm低 5 10 120sec LA PCR 的退火时间可以估算为 60sec 2 5sec 100bp 提高特异性 1 提高退火温度 2 5 可以降低非特异匹配的几率 2 缩短退火时 间 因为过长的退火时间通常不会提高产量 反而会增加错误匹配的几率 3 5 9 延伸 延伸 Extension Polymerizati