电镜技术与肾脏超微结构病变

电子显微镜技术与肾脏及其超微结构病变 特点 摘要摘要 电子显微镜在临床研究和疾病诊断中作出了巨大的贡献 并 不断开辟着生物医学研究的新领域 主要从细胞 亚细胞的形态结构 上阐明疾病的发生 发展及转归规律 丰富了传统病理学的知识 本 文归纳了电子显微镜技术与肾脏超微结构病变研究中的关键问题 指 出了肾脏病变及其超微结构研究的主要进展 讨论了肾脏超微结构病 变的类型 影响因素 过程机理等问题 在此基础上 对肾脏超微结构 病变规律的研究前景进行了展望 关关键词键词 电子显微镜技术 肾脏病变 超微结构 病变特点 电子显微镜包括扫描电子显微镜和透射电子显微镜两种类型 利用透射电子显微镜可以观察样品内部超微结构 利用扫描电子显 微镜可以观察样品表面形貌 立体感强 在生物医学领域应用较多的 是透射电子显微镜 透射电子显微镜的发明为人类在医学科学研究领 域做出了巨大的贡献 早在 20 世纪 40 年代电子显微镜就在医学上 开始发挥其作用 在病毒学 细胞生物学 组织学 病理学 分子生物 学及分子病理学都有应用 电子显微镜技术在肿瘤诊断 病毒和病毒 性疾病 系统性疾病等研究领域的应用 说明其是现代临床研究和疾 病诊断中不可缺少的重要工具之一 电电子子显显微微镜镜技技术术在医学在医学领领域域应应用特点用特点 随着科学技术的发展 电子显微镜放大倍数已从第一台电镜的 十几倍提高到现在的百万倍 因此在生物医学领域利用高性能的电 子显微镜观察细胞中各种细胞器正常的和病理的超微结构 诸如内 质网 线粒体 高尔基体 溶酶体 细胞骨架系统等 对探明病因和治 疗疾病有很大帮助 通过研究细胞结构和功能的关系 也可以研究细 胞的通讯与运输 分裂与分化 增殖与调控等生命活动的规律 电子 显微镜也可结合各种制样技术观察病毒 细菌 支原体 生物大分子 等的超微结构 是现代生物医学研究不可替代的工具 随着显微医学的发展 电镜技术将会与免疫学 分子生物学和摄 影技术 计算机等技术相结合 更好的为医学研究提供平台 还会利 用计算机建立三维立体图象 确切定位细胞位置及状态 总之 电镜 技术与其他实验技术的结合最终会推动整个生物医学科学研究 选 自 1 电子显微镜技术在生物医学领域的应用 下面具体就肾脏超微结构以及肾脏病变超微结构展开讨论 肾脏 病变有很多种 每种病变都有其不同的超微结构病变特点 本文就以 下几种病变进行分析 并讨论其特点 来更深入的了解肾脏的病变 一 硬化性一 硬化性肾肾炎炎 硬化性肾小球肾炎 sclerosing glomerulonephritis 不是一个独立 的肾小球肾炎病理类型 而是许多类型肾小球肾炎的终末阶段 病变 特点是大量肾小球硬化 肾小管萎缩 消失 间质纤维化 起始病变的 类型多不能辩认 病理变化 两侧肾脏对称性固缩 表面呈微小颗粒状 故称之为颗 粒性固缩肾 granular nephrosclerosis 切面观 皮质变薄 皮髓质分 界不清 光镜下大量肾小球硬化 玻璃样变 超过全部肾小球的50 肾 小球中央部分变为无细胞 嗜伊红 PAS阳性之玻璃样小体 周围部 分纤维化 少数肾小球结构残存 硬化肾小球所属肾小管萎缩 消失 使玻璃样变的肾小球相互靠拢集中 残留肾单位常呈代偿性肥大 肾 小球体积增大 肾小管扩张 间质纤维组织增生并有大量淋巴细胞 浆细胞浸润 间质内小动脉硬化 管壁增厚 管腔狭窄 选自2 局灶 节段性肾小球硬化病理形态特点及足细胞损伤研究 图一 图二 弥漫性硬化性肾小球肾炎 肾小球纤维化 玻璃样变 肾小管也 大部分萎缩纤维化 间质纤维组织增生 有多数慢性炎细胞浸润 图三 弥漫性硬化性肾小球肾炎 大量肾小球纤维化 玻璃样变 相互 靠近 集中 残存的肾小球呈代偿性肥大 晚期硬化性肾炎病人常有贫血 持续性高血压和肾功能不全 而 尿常规检查往往变化不明显 由于大量肾单位被破坏 功能丧失 存 留的肾单位相对比较正常 血浆蛋白漏出不多 因而蛋白尿 血尿 管 型尿都不如早期那样明显 水肿也很轻微 大量肾单位丧失后 血流 只能通过存留的肾单位 故血流通过肾小球的速度加快 肾小球滤过 率和尿液通过肾小管的速度也随之加快 但肾小管的重吸收功能有一 定限度 所以大量水分不能再吸收 肾的尿浓缩功能降低 从而出现 多尿 夜尿 尿的比重降低 常固定在1 010左右 选自3 263例成人原 发局灶节段肾小球硬化性肾炎病例及临床分析 晚期 大量肾单位纤维化 肾组织严重缺血 肾素分泌增加 病人 往往有明显的高血压 高血压可促使动脉硬化 进一步加重肾缺血 使血压持续在较高水平 长期高血压可引起左心室肥大 严重时甚至 可导致心力衰竭 晚期肾炎时肾单位大量破坏 残留的肾单位逐渐减 少 最后造成体内代谢废物不能排出 水电解质代谢和酸碱平衡调节 发生障碍 最后可导致氮质血症和肾功能衰竭 此外 由于肾组织大 量破坏 促红细胞生成素生成减少 长期肾功能不全引起的氮质血症 和自身中毒抑制骨髓造血功能 故病人常有贫血 二 膜性二 膜性肾肾小球小球肾肾炎炎 膜性肾小球肾炎 membranous glomerulonephritis 是临床上以大 量蛋白尿或肾病综合征为主要表现 病理上以肾小球毛细血管基底膜 均匀一致增厚 有弥漫性上皮下免疫复合物沉积为特点 不伴有明显 细胞增生的独立性疾病 透射电镜下见 多数肾小球毛细血管基膜外上皮细胞下及基膜 外侧有电子致密物的沉积 基膜呈不同程度的增厚 期 在肾小球 毛细血管基膜外上皮细胞下有体积较小 分布不均的少量电子致密 物 致密物区可见足细胞突起的融合 而基膜无明显的增生 期 在肾小球毛细血管基膜外上皮细胞下有体积较大 大量的电子致密 物分布 致密物有的陷入基膜致密层 致密物之间有明显的基膜增生 形成钉突样结构 足细胞间突起大部分融合 足细胞表面有假绒毛形 成 基膜有所增厚 图 1 Bar 500nm 期 在肾小球毛细血管基 膜的上皮细胞下电子致密物较多 且体积不等 位于增厚的基膜内 有的电子致密物周围可见呈虫蚀状较窄透亮区 有的电子致密物密度 降低 使增厚的基膜内出现透亮区 图 2 Bar 1Lm 足细胞间突起 广泛融合 胞质内微丝增多 其表面可见假绒毛 基膜增厚 期 电 子致密物大小不等 形状不一包含在基膜中 系膜基质明显增多 足 细胞间突起广泛融合 近年来的研究证明 肾小球原位免疫复合物的 形成在发病机理中起主要作用 由于抗原性质的不同所引起的抗体 反应也不同 可在肾小球不同的部位形成 膜性肾病是体液致病 从 超微结构上看 其主要特点为肾小球毛细血管基膜外上皮细胞下电 子致密物沉积和基膜样物质增生 最终导致肾小球毛细血管基膜的 弥漫性增厚 选自 4 膜性肾小球肾炎的超微结构观察 膜性增生性肾小球肾炎 型 的形态特征免疫荧光显示以肾小 球毛细血管襻和系膜区分布的突出的 IgG 或 C3 沉积为主 其形态常 呈粗颗粒 粗短线或条索状 图 3a 电镜检查发现电子致密物多位于 毛细血管内皮下或系膜区 图 3b 图 3 膜性增生性肾小球肾炎 型 a 免疫荧光示 IgG 集中分布于肾小球毛细血管襻和 系膜区 呈颗粒状 片状或短线状 高倍放大 b 电镜示电子致密物 D 集中分布于内 皮下 系膜区 基膜 BM 毛细血管 CAP Bar 11Lm 三 狼三 狼疮疮性性肾肾炎炎 狼疮性肾炎 LN 是系统性红斑狼疮 SLE 累及肾脏所引起的一种 免疫复合物性肾炎 是 SLE 主要的合并症和主要的死亡原因 系统性 红斑狼疮 systemic lupus erythematosus SLE 是一种临床表现为有多 系统损害症状的慢性系统性自身免疫疾病 其血清具有以抗核抗体为 主的大量不同的自身抗体 本病病程以病情缓解和急性发作交替为特 点 有内脏 肾 中枢神经 损害者预后较差 系统性红斑狼疮是一种 严重危害人类健康的常见疾病 最常累及的器官是肾脏 即狼疮性肾 炎 近乎 100 的患者肾脏有损害 近年来 随着细胞凋亡理论的引 入 人们对细胞凋亡在狼疮性肾炎发病机制中的作用有了不同程度 的研究 认为狼疮性肾炎可能与细胞凋亡有关 电镜下见 肾小球内皮细胞下有大块状的电子致密物沉积 图 1 系膜内 上皮细胞下 基底膜内也有电子致密物沉积 肾近端小管上 皮细胞有凋亡产生 其多以局灶性分布 肾小管腔内可见脱落的凋亡细 胞 近端小管上皮细胞在凋亡产生过程中 胞体逐渐变小 胞质基质密 度增加 核膜模糊 破损 消失 核内染色质浓缩 边聚 核破碎 最后形 成凋亡小体 凋亡小体形态不规则 有的外被质膜 有的裸露为电子密 度高的团块或内含破损的核内染色质及一些变性崩解的细胞器 有的 凋亡小体被邻近的细胞所吞噬 图 2 在正常生理情况下 细胞凋亡 和细胞增殖之间的平衡决定了组织器官的内稳定状态 细胞凋亡在肾 脏疾病的发生 发展过程中发挥着极其重要的作用 目前认为狼疮性 肾炎与细胞凋亡有关 在器官水平上 肾小球的增殖 硬化与细胞凋亡 的关系 可能决定肾小球病变的最终结局 肾小管损伤是肾小球疾病 进展机制之一 其在急慢性肾衰发病中占有一定的比例 一般认为狼 疮性肾炎主要病变在肾小球 其肾小球系膜增殖区及内皮细胞有凋亡 发生 而有关肾小管上皮细胞发生凋亡的报告却比较少 有研究发现 肾小管上皮细胞的凋亡在急性肾衰发生 急性肾小管损伤恢复 多囊 肾发病过程中起着一定的作用 也有报告梗阻性黄疸大鼠肾近端小管 上皮细胞有凋亡存在 我们在观察中看到 狼疮性肾炎肾近端小管上 皮细胞有明显的凋亡发生 肾小管腔内可见到脱落的凋亡细胞 有的凋 亡小体被邻近的细胞所吞噬 这些改变都影响着肾小管的重吸收及分 泌功能 从而进一步加重了对肾脏的损害 通过对狼疮性肾炎活检组 织的超微结构观察 我们认为肾小管上皮细胞凋亡的发生 不仅能够显 示狼疮性肾炎病变的部位 且在肾脏疾病的发生 发展过程中起着极 其重要的作用 选自 6 狼疮性肾炎近端小管上皮细胞凋亡的超微结构观察 四 脂蛋白四 脂蛋白肾肾病病 脂蛋白肾病是一种新型的肾小球疾病 是 1987 年在日本由 Saito T 首次报道的 过去只报道过 25 例 其中两例为国内所报道 有 关脂蛋白肾病发病机理尚不清楚 目前 对脂蛋白肾病的 ApoE 表现 型的检测显示 大多数为含 E2 的杂含子 其等电点使它易与带负电 荷的肾小球毛细血管基底膜相结合而不易清除 可能引致脂蛋白血栓 的形成 实验研究还认为 ApoE 中富含低和极低密度脂蛋白 可激活循 环中单核吞噬细胞 高胆固醇血症既可引起血浆渗透压升高 损伤内 皮细胞 也可促使单核细胞对内皮细胞的粘附力加大 增强其粘连 单核细胞经胞膜受体结合摄取脂质 由于其正常清除功能受阻 必然 增加胞内脂质的含量 两例中我们所看到的肾小球毛细血管内有大量 脂蛋白血栓 以及滞留在扩张管腔中 与内皮细胞紧贴着的单核吞噬 细胞体内 充满着大量大小不一的脂滴和初 次级溶酶体 选自 8 脂 蛋白肾病超微结构观察和分析 脂蛋白肾病包括肾小球体积明显增大 分叶状 高度扩张的襻腔 内见脂蛋白 栓子 形成等 肾小管一间质慢性化病变与小球病变不成 比例 同时还可见间质血管的变化等 见图 1 虽然襻腔内栓子含大 量脂质成分 但苏丹 染色阴性 而油红 O 染色阳性 见图 2 免疫荧 光染色可见不同程度的免疫球蛋白和补体阳性 7 例患者中 6 例襻腔 内见团块状的 apoA 例 2 阴性 apoB 及 apoE 染色阳性 见图 3 最 特征性的超微结构改变为襻腔内含脂质成分的 呈层状改变的巨大 栓子 见图 4 脂蛋白肾病患者肾组织中各种病变的榆出率 体增大 为 100 O 肾小球分口 r 为 100 O 襻扩张 50 襻 为 100 O 襻内栓子 50 襻 为 100 O 小管萎缩为 50 o 间质纤维化为 50 O f L 管透明变性为 28 6 血管纤维素样变为 28 6 免 疫荧光 apoA 为 85 7 apoB 为 100 0 apoE 为 100 o 超微结 构发现襻内栓子 50 襻 为 100 0 系膜插入为 57 1 新形成 基膜为 57 基膜增厚为 100 O 选自 9 脂蛋白肾病患者的临床表现及 病理学特征 五 五 Fabry 病病 Fabry 病 又称 Anderson Fabry 病或弥漫性躯体血管角质瘤 1898 年由 Fabry 和 Anderson 两位学者首先报道故而命名 是一种较少见的 与 X 染色体连锁遗传的糖鞘脂类代谢疾病 白种人较东方人种更多见 Fabr 病的发病机制是由于 半乳糖苷酶 A alpha galactosidase A Gal A 先天性缺乏从而使其代谢底物三己糖酰基鞘脂醇 globotriao sylceramide Gb3 和二己糖酰基鞘脂醇的末端半乳糖酰基不能被裂解 而在体内储积 发生储积的主要部位包括血浆 血管内皮细胞 平滑肌 细胞和上皮细胞的溶酶体内 其致病基因位于 X 染色体长臂 Xq21 33 Xq22 上 分子生物学研究发现 它有 300 余种变异 包括氨基 酸置换 基因重组和 RNA 表达缺陷等 Fabry 病患者以男性为主 发 病率为 1 60 000 1 40 000 且男性患者 半合子 病情重于女性患者 杂 合子 女性纯合子患者多难以存活 起病大多数在儿童和青少年时期 典型患者表现为皮肤血管角质瘤 发作性周围神经痛 手 足 四肢关 节 肌肉等 角膜和晶状体浑浊 视网膜动脉曲张以及少汗症等 病 情呈进行性加重 逐渐累及心脏 脑血管和肾脏等器官 大多数患者于 40 50 岁时因心脏 脑血管并发症或尿毒症死亡 肾脏是 Fabry 病损伤 的主要靶器官之一 也是导致死亡的重要原因之一 常规方法处理标 本 可使 Gb3 丢失 再进行 HE 和 PAS 染色可见不到空泡状细胞 用 Luxol 固蓝染色 可在常规切片上见到溶酶体脂质 在冰冻切片上进行 PAS 染色 Luxol 固蓝染色 油红氧染色 苏丹黑染色等可见积聚的 脂质 植物凝集素染色可特异性检出 和 半乳糖苷酶残基 一般组 织应用戊二醛或 Trump 液固定 用 Epon 包埋 切片用甲苯胺蓝染色或 亚甲蓝 天青 染色 光镜改变特点 主要表现为肾小球足细胞病变 足 细胞呈弥漫性 细小的空泡变性 类似蜂窝状 足细胞数量减少 部分足 细胞脱落至包囊腔中 可见肾小球袢与囊壁的粘连 少数患者表现为肾 小球局灶阶段性硬化 因此 常误诊为原发性局灶阶段硬化性肾小球肾 炎 此外 肾小球系膜细胞 毛细血管内皮细胞 壁层上皮细胞以及肾 间质动脉平滑肌细胞中 也可出现类似的空泡样变 进行甲苯胺蓝染 色 肾小球足细胞胞浆内可见大量 深浅不一的嗜甲苯胺蓝颗粒物质 少数肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞亦可见嗜甲苯胺蓝颗粒物质 选自 10 Fabry 病的肾脏病变及诊治进展 超微结构改变特点 肾小球足细胞胞浆呈弥漫性肿胀 可见大量嗜 锇性 同心圆样包涵体 肾小球内皮细胞 壁层上皮细胞 间质血管内 皮细胞和肾小管上皮细胞也见类似的少量包涵体 为此在临床上 也进行了大量的检测 临床资料 例患者中 例为女性 例 例为为男性 例 和例 年龄分别为4 岁 7岁 岁 临床均以蛋白尿为主 伴有血尿 例患者查体未发现感觉和眼部异常 全身皮肤黏膜未见出血点 4 尿蛋白定量分别为0 625 3 33 5 0 血白蛋白分别为 39 2 28 3 23 6 血肌酐分别为 65 59 2 225 4 正常值为70 106 例 和例 胸片 心电图和心脏超声未见明显异常 例 心脏彩超示左室壁增厚 左室舒张功能减退 二尖瓣 三尖瓣和 主动脉瓣返流 心电图示左心室高电压 心肌缺血 听力检查示患者听 力下降 免疫荧光 例1 和 均阴性 例 仅见节 段系膜区 和 均阴性 例 免疫荧光标本 无肾小球 光镜检查肾小球系膜细胞和内皮细胞无明显增生 毛细血管基底 膜无明显增厚 足细胞体积增大 胞质内出现大量细微的空泡 呈泡 沫状 图 可见程度不同的节段性硬化和球性硬化 肾小管上皮空 泡变性 可见蛋白管型和萎缩 肾间质可见淋巴细胞 浆细胞浸润伴 纤维化 小动脉管壁增厚 管腔狭窄 平滑肌细胞空泡变性 例 肾 小管 肾间质病变要轻于例 例 电镜检查 例电镜改变基本一致 肾小球系膜细胞和内皮细胞无 明显增生 毛细血管基底膜厚度正常 毛细血管腔通畅 足突广泛融 合 足细胞胞质内可见大量嗜锇性髓鞘样包涵体 圆形或卵圆形 明 暗相间呈板层状 大小为 畅3 10 多数为1 3 外有单位 膜包绕 图 此外远端肾小管上皮细胞胞质内亦可见少量这种髓鞘 样包涵体 以肾脏损害为主要表现的 病的诊断必须依靠肾活 检 免疫荧光染色无特异性 常为弱阳性或阴性 光镜下主要病变为 肾小球足细胞体积增大 胞质空泡化 泡沫样变性 使得整个肾小球 呈蜂窝状 这对 病的诊断具有提示意义 此外肾小球还可出 现系膜细胞增生 基质增多 基底膜增厚等改变 少数文献报道 病患者的肾活检还可以出现新月体性肾小球肾炎改变 病变 晚期肾小球可出现局灶的节段性硬化或球性硬化 肾小管和肾间质也 可发生改变 表现为肾小管上皮细胞空泡变性 灶性萎缩 肾间质灶 性纤维化 部分病例可伴有血管病变如小动脉透明变性 小血管内皮 细胞泡沫变性 电镜检查是确诊 病的重要手段 电镜下肾小球 足细胞胞质内出现大量嗜锇性髓鞘样包涵体 此外 远端小管和集合 管上皮细胞 血管内皮细胞内也可见到这种髓鞘样包涵体 但以肾小 球足细胞受累最广泛 程度最重 本组 例病例光镜均呈局灶节段肾小球硬化症 样改变 足细胞弥漫性 空泡变性 电镜下足细胞胞质内可见大量嗜锇性髓鞘样包涵体 病肾病的诊断可 以确立 一般认为肾小球足细胞病变是导致 病患者出现肾脏损 害的主