实验室中文版原位杂交

In situ hybridization final edition 第一部分 第一部分 1 固定 第一天 下午 固定 第一天 下午 1 用 DEPC 水配制 8 多聚甲醛 粉末 作为储备液 4C 可保存 1 月 2 多聚甲醛 粉末 8g 溶解于 100ml DEPC 水中 60C 孵育 30min 此时 多聚甲醛不溶 加入 10N NaOH 15ul 调节 pH 值于 7 4 左右 用手振 荡 多聚甲醛将快速溶解 3 用 8 多聚甲醛储备液和 PBS 缓冲液配制 4 多聚甲醛 8 多聚甲醛储 备液 50ml 10 PBS DEPC 配制 10ml DEPC 水 40ml 4 的多聚甲 醛作为工作液在 1 周内使用 4 将组织块放置于 10 体积的 4 多聚甲醛溶液中固定 1 2h 室温 其间 缓慢摇动 4C 放置过夜 16h 其间缓慢摇动 注意 固定时 一定要保证多聚甲醛和材料中水分的充分交换 否则会造成注意 固定时 一定要保证多聚甲醛和材料中水分的充分交换 否则会造成 材料不能很好固定 材料不能很好固定 2 脱水 第二天 早晨 脱水 第二天 早晨 按下列顺序对材料进行脱水 1 PBS DEPC 5min 2 次 70 乙醇 DEPC 5min 80 乙醇 DEPC 5min 90 乙醇 DEPC 5min 100 乙醇 5min 脱水时间应随组织的体积大小适当变化 100 乙醇 30C 过夜 注意 脱水时间的长度长一点不会对材料造成太大影响 但若脱水时间不够 注意 脱水时间的长度长一点不会对材料造成太大影响 但若脱水时间不够 用二甲苯透明的时候会让二甲苯浑浊 不能进行很好的置换 直接影响包埋效用二甲苯透明的时候会让二甲苯浑浊 不能进行很好的置换 直接影响包埋效 果 果 3 包埋 包埋的时间依据材料的大小而定 包埋 包埋的时间依据材料的大小而定 将材料转移到 100 乙醇中 室温放置 15min 再次在 100 乙醇中放置 10 15min 100 乙醇 二甲苯 30min 二甲苯浸泡 30min 2 次 注意 二甲苯浸泡时间不确定 依据为材料透明即可 如若透明时间过长 注意 二甲苯浸泡时间不确定 依据为材料透明即可 如若透明时间过长 会使材料过脆 包埋好的材料在切片时会破碎 会使材料过脆 包埋好的材料在切片时会破碎 二甲苯 石蜡 30min 石蜡 30min 石蜡 40min 根据常规包埋方法进行包埋 注意 包埋过程中 二甲苯一定要脱干净 否则也会使材料变脆 因此在注意 包埋过程中 二甲苯一定要脱干净 否则也会使材料变脆 因此在 III 蜡中放置的时间可以酌情延长 依据材料的体积而定 蜡中放置的时间可以酌情延长 依据材料的体积而定 Note 组织过大 二甲苯未能使材料内的部分透明 切片时 此处材料会脱 组织过大 二甲苯未能使材料内的部分透明 切片时 此处材料会脱 落 造成空洞 可否考虑落 造成空洞 可否考虑 100 乙醇乙醇 二甲苯浸泡时间稍微延长 二甲苯浸泡时间稍微延长 4 组织切片 组织切片 注意 切片材料为全鱼或者去除内脏的幼鱼片段时 骨骼 尤其是脊柱 会注意 切片材料为全鱼或者去除内脏的幼鱼片段时 骨骼 尤其是脊柱 会 损伤切片刀片 造成切片脆裂或者切痕 在展片时 材料会破裂 因此 在切损伤切片刀片 造成切片脆裂或者切痕 在展片时 材料会破裂 因此 在切 片时 一旦发现材料破碎或者出现刀痕 必须将切片刀片横移 避开刀片时 一旦发现材料破碎或者出现刀痕 必须将切片刀片横移 避开刀片缺口 片缺口 切片厚度应为 5 8um 应同时准备一些该材料的组织切片用于 HE 染色 组 织切片时为避免 RNase 污染 应保持使用无粉手套和 DEPC 水 切片完全干燥 后应保存于 4C 贴片 展片 所用已经 coating 的玻片一般只使用远离书写端 1 3 处 一来 可以节约随后步骤中使用试剂的量 二来节约切片材料 三便于封片 展片时 先用滴管将 DEPC 水在靠近 1 3 处涂抹很薄一层液体 将弯钩解剖 针挑取单张材料切片 尽可能切割整齐 放于液面 此时 材料将浮于液面 注意不要将切面朝上 用滤纸将远端多余水分吸去一部分 以免过度展片 放置 3 5 行 视材料宽度而定 于 39 42C 的展片机上展片 Slide cleaning 5 Decon 90 清洗 1h 自来水冲洗 2h 蒸馏水冲洗数次并在 200C 干燥 8h 并用手套将玻片放置于玻片盒中 保存于 4C Poly L Lysine coating 用 10mM Tris HCl 缓冲液 pH8 0 配制 50ug ml 多聚赖氨酸溶液 并向无 RNase 的玻片上滴加多聚赖氨酸溶液 37 干燥 24 h 第二部分第二部分 探针制备探针制备 1 将目的基因的 cDNA 或 ORF 插入到 pGEM T Easy 载体 Promega 或者其 他带有 T7 和 SP6 RNA 聚合酶结合位点的载体 提取质粒 DNA 并测序 验证 2 测序验证后 挑选含所需插入方向的质粒 用 T7 和 SP6 结合位点外围的前 后引物扩增包含 T7 和 SP6 结合位点和目的片段的线性 DNA 3 PCR 产物的纯化和定量 4 0 5 1ug PCR 产物用于 T7 和 SP6 的体外转录 制备探针 T7 的转录效率比的转录效率比 SP6 高 一般用高 一般用 T7 合成反义链 而合成反义链 而 SP6 合成正义链探针 合成正义链探针 如果可能 直接将欲作为合成探针的模板克隆入如果可能 直接将欲作为合成探针的模板克隆入 pGEM T 载体中 然后通载体中 然后通 过过 PCR 合成转录模板 克隆入普通亚克隆载体 如 合成转录模板 克隆入普通亚克隆载体 如 pMD 19T 中 然后 中 然后 用用 T7 M13 和和 SP6 M13 引物成模板后 转录的效果不是太好 引物成模板后 转录的效果不是太好 0 5 1ug PCR product l 10X DIG RNA labeling mix2 l 10X Transcription buffer2 l T7 or SP6 polymerase 20U l 2 l 共 40U RNase inhibitor 40U l 1 l 共 40U DEPC DW l 总体积20 l 5 混合并离心 6 37C 温育 2 3h 7 加入 DNase I RNase free 10U ul 2ul 混合并离心 8 37C 温育 15min 9 加入 50ul 100 乙醇 2 5 体积 2ul 1 10 体积 NaAC 10 涡旋混匀 在 20C 放置 2 6h 或者过夜 11 4C 14000rpm 离心 30min 12 用 70 DEPC 乙醇洗一次 13 4C 14000rpm 离心 15min 14 移去乙醇并室温放置 5min 使乙醇挥发 15 加入 50 ul DEPC 水和 1ul RNase 抑制剂 16 使用前测量 RNA 探针浓度 Sp6 100ng ul T7 400ng ul 17 探针可在 80C 保存 1 月 化将目的片段化将目的片段 ORF 插入到插入到 pMD 19T 载体中 挑选一定插入方向的克隆 用载体中 挑选一定插入方向的克隆 用 T7 M13 和和 SP6 M13 引物扩增目的片段 使其带上引物扩增目的片段 使其带上 T7 和和 SP6 的启动子序列 的启动子序列 电泳纯后 作为电泳纯后 作为 RNA 探针合成的模板 探针合成的模板 一张用于原位杂交的切片一般需要加入一张用于原位杂交的切片一般需要加入 200ul 左右的探针 左右的探针 注意 这种方法合成出的模板 是否能很好合成注意 这种方法合成出的模板 是否能很好合成 RNA 探针 还需要深入的证探针 还需要深入的证 明 明 第三部分第三部分 in situ hybridization 第一天 杂交 同时准备正义探针 T7 和反义探针 SP6 1 复水 二甲苯 5min 3 次 如近期再次实验 试剂可反复利用 如近期再次实验 试剂可反复利用 100 乙醇 1 5min 2 次 90 乙醇 1min 80 乙醇 1min 70 乙醇 1min 0 85 X PBS 1 5min 0 85 X PBS 2 5min 0 85 X PBS 3 5min 2 37C 蛋白酶 K 4 10ug ml 从 20mg ml 储备液稀释 处理 5 15min 成鱼卵 巢 15min 幼鱼卵巢 10min 胚胎 稚鱼 精巢 5min Tilapia 幼鱼和 成鱼 用蛋白酶 K 10ug ml 处理 5min 即可 Kobayashi 3 0 85X PBS 洗 5min 4 4 多聚甲醛在室温中再次固定 15min 5 2mg ml 甘氨酸 蛋白酶蛋白酶 K 的抑制剂 的抑制剂 从甘氨酸储备液 20mg ml 稀释 室 温处理 15min 6 0 1M TEA 三乙醇胺 50 TEA 2 65ml 2N HCL 1 05 ml DEPC 100ml 处理 5min dilute from stock before using 室温 7 0 25 乙酸苷 0 1M 三乙醇胺 用前向 0 1M TEA 中加入乙酸苷 10min 100ml 0 1M TEA 250ul acetic anhydride 室温 8 2 X SSC 5min RT 9 预杂交 66 去离子甲酰胺 2 X SSC 60C 孵育 1h 在染缸中进行 本实验时原位杂交一般使用液体体积为 70 80ml 高度以刚好淹没材料 为准 50 ml 预杂交液 去离子甲酰胺 33ml 20XSSC DEPC 5ml DEPC 水 12ml 10 60C 65C 于杂交缓冲液中杂交 14 16hr 湿盒中进行 可在其中加入预杂 交液 以保证杂交过程中杂交体系不会干 然后将湿盒封闭 避免在高 温下 盒内湿度下降 一张用于原位杂交的切片一般需要加入一张用于原位杂交的切片一般需要加入 200ul 左右的探针 左右的探针 Save probe for re use if the probe is OK Note 所有在高于室温下进行的湿盒中反应 均需将湿盒封闭 所有在高于室温下进行的湿盒中反应 均需将湿盒封闭 Hybridization buffer Final concentrationto prepare 10ml Formamide60 6ml 1 0M Tris HCL pH 8 0 0 02M200ul 0 5M EDTA pH 8 0 0 0025M50ul 100Xdenhardt s solution1X100ul NaCl 2 5M 0 3M1 2ml 50 dextran sulfate7 5 1 5ml DEPC treated DWX950ul Keep the hybridization buffer at 20C Prepare the hybridization solution Probe with final concentration 200 500ng ml tRNA 20mg ml 1ul ml Hybridization buffer According to the number of your slides Water bath at 80C for 10min to denature RNA probe Load the hybridization solution with probe to slides 第二天 Wash and staining 从这一步开始 溶液可以用蒸馏水进行配制 无 需 DEPC Washing rinse 1 50 formamide 2XSSC 55C 60C 20min 2 50 formamide 2XSSC 55C 60C 20min 用 用 20XSSC 配置 切勿用配置 切勿用 2XSSC 直接配置 直接配置 3 2XSSC 37C 10min 4 RNase treatment RNase 2XSSC 100 g ml RNase A 的浓度应 为 10 100ug ml RNase 专用湿盒 5 2XSSC 60C 20min 6 0 2XSSC 60C 20min Note Please increase the time and times of washing if the background is very high 染色 1 DIG1 洗涤 室温 5min DIG1 buffer Final concentration for 300ml Maleic acid 0 1M 3 48g NaCL 0 15M 2 63g pH to 7 5 Add D W to 300 ml Autoclave 注意 根据罗氏说明书 未稀释抗体保存于注意 根据罗氏说明书 未稀释抗体保存于 4C 可放置至产品失效日期 可放置至产品失效日期 稀释后的抗体 在稀释后的抗体 在 4C 仅能保存仅能保存 12h 切忌冻存 切忌冻存 2 DIG2 封阻 DIG1 中加入 1 封阻剂 BSA 30min 室温 Chamber3 3 Anti DIG AP is diluted by 500 10000 times in DIG2 最好依据产品说明 最好依据产品说明 书稀释书稀释 2000 5000 倍 即使抗体的量较少 也可通过延长显色时间进行调整 倍 即使抗体的量较少 也可通过延长显色时间进行调整 30min 室温 Chamber3 稀释后的抗体可重复使用 4 DIG1 洗涤 15min 3 5 DIG3 检测 15min DIG3 缓冲液 底物 Total 30ml 1M Tris Hcl pH 9 5 3ml 5M NacL 0 6ml 1M MgCL2 1 5ml DEPC 24 9ml 呈色緩衝液 staining buffer 100mM Tris pH 9 5 50mM M