卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究

实验一实验一 卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究 1 1 实验原理实验原理 果蔬中的过氧化物酶 peroxidase 往往具有较高的热稳定性 对果蔬进 行热烫处理时 常以过氧化物酶是否失活作为热烫是否充分的标准 许多研究 表明果蔬中的过氧化物酶有热稳定和热不稳定两部分 这两部分的比例取决于 果蔬的品种和热烫处理的温度 过氧化物酶催化的典型反应为 H2O2 AH2 A 2H2O AH2是无色的还原性化合物 如果它经过氧化转变成有色的 A 那么反应体 系在特定波长下的吸光值就会随反应进行而增加 因此 可以用分光光度法测 定过氧化物酶的活力 2 试剂和仪器 试剂 0 05mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 含 1 0mol L NaCl 缓冲液 0 1mol L 磷酸盐缓冲液 pH7 0 缓冲液 1 邻苯二胺 乙醇溶液 0 3 过氧化 氢溶液 仪器 组织捣碎机 抽滤装置 水浴锅 721 分光光度计 含比色皿 秒表 常规玻璃仪器 3 实验步骤 1 从卷心菜中提取过氧化物酶 125g 卷心菜 125mL 缓冲液 均质 20000rpm 2min 匀浆 抽滤 液体 离心 8000rpm 15min 4 残渣 滤过液 粗酶液 2 过氧化物酶热处理 将从卷心菜中萃取得到的过氧化物酶粗酶液置于试管中 取适量酶液稀释 5 倍左右 过滤后测定酶活 另取适量酶液分别置于已编号的试管中 将试管在 60 水浴中保温 1 min 然后移至 85 水浴锅中 分别处理 0 5min 1min 1 5 min 2 min 3 min 5 min 7 min 和 10 min 然后立即将试管转移至冰浴中 快速冷却至 0 再取适量酶液分别置于已编号的试管中 并将试管在 60 水浴中保温 1 min 然后在 100 下分别处理 15s 30 s 45 s 1 min 1 5 min 2 min 和 3 min 然后在冰浴中快速冷却 测定残余过氧化物酶活力 3 过氧化物酶活力测定 如果热处理后酶液中产生混浊 应在比色前过滤去除沉淀 向比色皿中加入 2 6mL 缓冲液 0 1mL 邻苯二胺 乙醇溶液 0 2mL 过氧 化氢溶液 然后加入 0 1mL 酶液 并立即搅匀计时 在 430 nm 下测定反应混合 物的吸光值随时间的变化 空白以缓冲液代替酶液 根据吸光值变化情况调节 加酶量 保持酶液和缓冲液体积之和恒定 4 数据记录与处理 1 粗酶液活力测定数据 时间 S 102030405060708090100110120 吸光度 0 1050 1870 2620 3420 4270 5080 5940 6820 7730 8670 9661 062 用 Excel 处理数据 得到下图 加酶量 0 1mL 稀释倍数为 5 1mL 原酶液 4mL 蒸馏水 由图可知 直线的斜率为 0 5198 也就是说每分钟吸光度值上升 0 5198 由于稀释倍数为 5 倍 加酶量为 0 1mL 因此计算得出酶活力为 0 5198 50 25 99U mL 2 85 热处理后残余酶活测定数据 热处理时间不同的几组样品在不同稀释倍数及加酶量条件下分别测定了消光值 如下表 热处理 消光值 时间 s 102030405060708090100110120 85 0 5min0 0450 0880 1380 1880 2400 2930 3480 4050 4640 5230 5850 649 85 1 0min0 0470 0910 1360 1810 2290 2780 3270 3790 4320 4860 5410 599 85 1 5min0 0150 0320 0540 0750 0970 1190 1410 1650 1880 2110 2340 259 85 2 0min0 0420 0780 1170 1550 1930 2340 2750 3170 3610 4060 4520 499 85 3 0min0 0060 0120 0180 0250 0310 0380 0440 0520 0590 0660 0740 082 85 5 0min0 0040 0040 0050 0060 0080 0090 0110 0130 0150 0170 0190 021 85 7 0min0 0040 0030 0040 0040 0040 0030 0040 0040 0040 0040 0040 004 85 10 0min0 0030 0030 0030 0030 0030 0030 0030 0030 0030 0030 0030 003 数据处理如下图 85 30 秒 稀释 4 倍 加酶量 0 1mL 85 60 秒 稀释 3 倍 加酶量 0 1mL 85 90 秒 稀释 2 倍 加酶量 0 1mL 85 120 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 85 180 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 85 300 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 85 420 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 85 600 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 3 100 热处理后残余酶活测定 热处理时间不同的几组样品在不同加酶量条件下分别测定了消光值 如下表 热处理 消光值 时间 s 102030405060708090100110120 100 0 25min0 0820 1440 2080 2750 3430 4140 4870 5640 6430 7240 8090 897 100 0 5min0 1350 1760 2230 2830 3410 4040 4690 5360 6050 6750 7480 825 100 0 75min0 0040 0080 0120 0170 0210 0240 0290 0330 0380 0430 0470 052 100 1 0min0 0050 0080 0110 0140 0170 0210 0250 0280 0310 0340 0380 042 100 1 5min0 0880 0930 0960 1000 1070 1090 1140 1170 1220 1270 1310 135 100 2 0min0 0870 0910 0910 0920 0930 0940 0950 0990 0960 0980 0980 099 100 3 0min0 0980 0980 0970 0980 0980 0980 0990 0990 0990 0990 1000 100 数据处理如下面一系列图 100 15 秒 稀释 4 倍 加酶量 0 1mL 100 30 秒 稀释 3 倍 加酶量 0 1mL 100 45 秒 稀释 2 倍 加酶量 0 1mL 100 60 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 100 90 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 100 120 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 100 180 秒 稀释 1 倍 加酶量 0 1mL 4 酶活计算 Excel 处理数据 所的斜率 热处理条件酶液稀释 倍数 加酶量 mL 酶活 U mL 相对残余活 力 相对残余活 力对数 0 5198无50 125 99100 02 000 0 330385 热处理 0 5 40 113 21250 8351 706 0 300585 热处理 1 30 19 01534 6861 482 0 134185 热处理 1 5 20 12 68210 3191 0136 0 248885 热处理 2 未0 10 24880 957 0 0191 0 041385 热处理 3 未0 10 04130 1589 0 7989 0 009885 热处理 5 未0 10 00980 0377 1 4237 0 000285 热处理 7 未0 10 00020 0000077 5 114 0 000085 热处理 10 未0 10 00000 0 4435100 热处理 0 25 40 117 7468 2571 834 0 3810100 热处理 0 5 30 111 4343 9781 643 0 0261100 热处理 0 75 20 10 5222 00850 3029 0 0201100 热处理 1 未0 10 02010 0773 1 1118 0 0256100 热处理 1 5 未0 10 02560 0985 1 0066 0 0069100 热处理 2 未0 10 00690 0265 1 577 0 0013100 热处理 3 未0 10 00130 00005002 4 3009 5 相对残余活力 热处理时间曲线和相对残余活力对数 热处理时间曲线 在相对残余活力 热处理时间曲线中 最初的直线部分代表酶的热不稳定 部分失活 中间曲线部分可以认为是过渡区域 而最后的直线部分表示耐热部 分的失活 拟合最后平缓部分并延长 取最后三个点 可以得出它与纵坐标的 交点 由此可以估算出耐热部分活力占酶的总活力的比例 曲线如下图 由图中