植物内生菌DNA提取方法

在提取植物内生菌之前 植物需要表面灭菌 其具体操作为将植物浸泡在 添加了 0 02 的 Tween 20 的质量分数为 1 的次氯酸钠溶液中 1 min 再将植物 浸泡在 70 酒精中 1 min 然后用硫代硫酸盐 Ringer s 林格氏液 清洗 3 次 每 次 1 min 根和茎 土表面以上 1 cm 处 都要灭菌处理 将根茎切成片状 为了更好地分析细菌的位置 灭菌后茎表皮撕下 茎内部按照之前的方法灭菌 表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取 DNA 植物不同组织的内生菌群落 DNA 提取通过直接研磨植物组织 步骤为溶 解 提取和纯化步骤 方案一 或者在 DNA 提取前从片状植物组织中淋洗出 细胞 方案二 东南景天表面灭菌方法 东南景天表面灭菌方法 整株植物用自来水冲洗 30 min 用蒸馏水洗 3 次 每次 3 min 用吸水纸吸去植物表面水分 用无菌剪刀在根基部将根系剪下 与 植物地上部分开 将根系用 70 酒精浸泡 2 min 无菌水洗 3 次 3 NaClO 浸泡 2 次 每次 1 min 然后用无菌水冲洗 3 次 每次 2 min 最后一次清洗液 涂 LB 平板 1 将 2 g 左右消毒后植物组织于无菌研钵中 加 5 mL 磷酸钠缓冲液 19 9 g Na2HPO4 H2O 1 27 g NaH2PO4 2H2O H2O 定容到 1 L 研磨至匀浆 2 将植物匀浆转移至 50 mL 无菌离心管无菌离心管中 摇床 200 rpm 振荡 1 2 h 使细 菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来 3 取 4 mL 悬液于新的无菌离心管中 12 000 g 离心 10 min 收集菌体细 胞 4 弃上清 将收集的菌体细胞重新溶于 550 L 1 TE buffer Tris EDTA pH8 中加入 10 mg mL 1溶菌酶溶菌酶 10 L 37 水浴 1 4h 5 加入 50 L 20 SDS 和 8 L 20 mg mL 1蛋白酶蛋白酶 K 混匀 65 水浴 3h 期间轻轻上下颠倒混匀数次 6 加入 200 L 5 M NaCl 涡旋振荡 15 s 12000 g 离心 10 min 7 取上清液 并向上清液中加入等体积的氯仿氯仿 异戊醇异戊醇 24 1 彻底混匀 12000 g 离心 10 min 8 上清液转移至新的无菌离心管中 重复步骤 7 一次 9 上清液转移至新的无菌离心管中 加入 0 6 倍体积 0 6 vol 的冰冷的 异丙醇异丙醇 4 放置 1 h 10 4 12000 g 离心 10 min 弃上清 11 沉淀用 70 冰乙醇冰乙醇清洗 离心 弃上清 12 DNA 沉淀室温风干后 用无菌超纯水溶解 13 DNA 纯化采用 TIANquick Midi Purification Kit 微生物 16S rRNA 基因 V5 V6 V7 区域扩增引物 799F2 GATGG CCATT ACGGC CNNNN NN 1193R ACGCA TCCCC ACCTT CCTC 用含 10 SDS 提取缓冲液 NaP 缓冲液 重新悬浮细胞团块 用直径 0 11mm 的玻璃珠珠打操作 50 s 以溶解细胞 用苯酚苯酚 Tris pH 8 溶液和氯仿 异戊醇提取 用 0 6 vol 的异丙醇和 0 5 mol L NaCl 通过沉淀再次获得 DNA 用 70 的乙醇洗涤细胞团块 真空干燥 再溶解在 50 l 的超纯水中 原始 DNA 提取物用 Glassmilk purification kit Bio101 La Jolla CA 进一步纯化 所需试剂 Na2HPO4 H2O NaH2PO4 2H2O 10 SDS 十二烷基硫酸钠 Tris 饱和酚 氯仿 异戊醇 体积比 24 1 混合 异丙醇 0 5 mol L NaCl 70 乙醇 苯酚 氯仿 异戊醇在 DNA 提取时的作用 抽提 DNA 去除蛋白质时 怎样使用酚与氯仿较好 酚与氯仿是非极性分子 水是极性分子 当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时 蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去 使蛋白失去水合状态而变性 经 过离心 变性蛋白质的密度比水的密度为大 因而与水相分离 沉淀在水相下 面 从而与溶解在水相中的 DNA 分开 而酚与氯仿有机溶剂比重更大 保留 在最下层 作为表面变性的酚与氯仿 在去除蛋白质的作用中 各有利弊 酚 的变性作用大 但酚与水相有一定程度的互溶 大约 10 15 的水溶解在酚 相中 因而损失了这部分水相中的 DNA 而氯仿的变性作用不如酚效果好 但 氯仿与水不相混溶 不会带走 DNA 所以在抽提过程中 混合使用酚与氯仿效 果最好 经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚 由于酚与氯仿是互溶的 可 用氯仿第二次变性蛋白质 此时一起将酚带走 也可以在第二次抽提时 将酚 与氯仿混合 1 1 使用 为什么用酚与氯仿抽提 DNA 时 还要加少量的异戊酵 在抽提 DNA 时 为了混合均匀 必须剧烈振荡容器数次 这时在混合液 内易产生气泡 气泡会阻止相互间的充分作用 加入异戊醇能降低分子表面张 力 所以能减少抽提过程中的泡沫产生 一般采用氯仿与异戊酵为 24 1 之比 也可采用酚 氯仿与异戊醇之比为 25 24 1 不必先配制 可在临用前把一份 酚加一份 24 1 的氯仿与异戊醇即成 同时异戊醇有助于分相异戊醇有助于分相 使离心后的上上 层水相层水相 中层变性蛋白相中层变性蛋白相以及下层有机溶剂下层有机溶剂相维持稳定 Tris 平衡苯酚平衡苯酚的配制方法 1 使用原料 大多数市售液化苯酚是清亮无色的 无需重蒸馏便可用于分 子生物学实验 但有些液化苯酚呈粉红色或黄色 应避免使用 同时也应避免 使用结晶苯酚 结晶苯酚必须在 160 对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物 这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致 RNA 和 DNA 的交联等 因此 苯酚的质量对 DNA RNA 的提取极为重要 我们推荐使用高质量的苯酚进行 分子生物学实验 2 操作注意 苯酚腐蚀性极强 并可引起严重灼伤 操作时应戴手套及防 护镜等 所有操作均应在通风橱中进行 与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水 清洗 并用肥皂和水洗涤 忌用乙醇 3 苯酚平衡 因为在酸性 pH 条件下 DNA 分配于有机相 因此使用苯酚前 必须对苯酚进行平衡使其 pH 值达到 7 8 以上 苯酚平衡操作方法如下 液化苯酚应贮存于 20 此时的苯酚呈现结晶状态 从冰柜中取出的 苯酚首先在室温下放置使其达到室温 然后在 68 水浴中使苯酚充分溶解 加入羟基喹啉羟基喹啉 8 Quinolinol 至终浓度 0 1 该化合物是一种还原 剂 RNA 酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂 同时因其呈黄色 有助于 方便识别有机相 加入等体积的 1M Tris HCl pH8 0 使用磁力搅拌器搅拌 15 分钟 静置使其充分分层后 除去上层水相 重复操作步骤 加入等体积的 0 1M Tris HCl pH8 0 使用磁力搅拌器搅拌 15 分钟 静置使其充分分层后 除去上层水相 重复操作步骤 稍微残留部分上层水相 使用 pH 试