沈继录细菌耐药机制研究新进展

细菌耐药机制研究新进展,沈继录安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学第一附属医院检验科,1,细菌耐药机制,遗传性耐药,获得性耐药,固有耐药,染色体突变耐药,灭活酶和钝化酶的产生,氨基糖苷类钝化酶,大环内酯类药物钝化酶,内酰胺酶,氯霉素乙酰转移酶,抗生素作用靶位的改变,细胞膜通透性改变,细菌的主动外排功能,细菌生物被膜的形成,细菌耐药的基因机制,根据遗传特性，将细菌耐药性分为两类 1.固有性耐药：来源于该细菌本身染色体上的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特异性。2.获得性耐药：由于细菌在生长繁殖过程中，其DNA发生改变而使其形成或获得了耐药性表型,CLSI有关于固有耐药的内容,4,获得性耐药产生类型：1.染色体介导的耐药性2.质粒介导的耐药性,染色体介导的耐药：一般是由于遗传基因DNA自发变化的结果，具有典型的种属特异性，能够代代相传。细菌的这类耐药性，一般对一种或两种相类似的药物耐药，且比较稳定，耐药性的产生与消失与药物接触无关，在自然界中这类耐药菌占次要地位。,质粒介导的耐药：这类耐药性是由于细菌获得外源新基因而产生的。细菌外源耐药性基因既可以通过染色体垂直传播而获得，又可以通过质粒或转座子水平传播而获得。因此，细菌耐药性的传播方式主要有转化(transformation)、转导(transduction)、接合(conjugation)和转座(transposion)4种。,细菌耐药机制,PBP,PBP,PBP,g,g,g,plasmid,AB,AB,III通透性降低,I 抗菌药物钝化,IV主动外排,抗菌药物钝化酶,II 抗菌靶位变异,2017/12/22,8,细菌耐药的生化机制,一、灭活酶或钝化酶的产生 1.-内酰胺酶 2.氯霉素乙酰基转移酶 3.红霉素酯化酶 4.氨基糖苷类钝化酶（乙酰转移酶：磷酸转移酶：核苷转移酶）,-内酰胺酶：最主要的灭活酶,目前已发现750种以上新的种类不断出现对-内酰胺抗生素造成严重威胁,http:/WWW./Study,具体种类、氨基酸位点改变及等电点见:,2017/12/22,10,-内酰胺酶分类,2017/12/22,11,-内酰胺酶,金属碳青霉烯酶：活性部位需要有锌离子结合，包括：NDM-1、IMP、VIM、GIM、SIM、SPM等型别。,非金属碳青霉烯酶：活性部位不需要金属离子存在，包括OXA(D类)、KPC（A类）代表酶。,2017/12/22,12,-内酰胺酶热点,近年来，与细菌耐药发展和新抗生素开发密切相关的内酰胺酶有4类：ESBLs；对酶抑制剂敏感性下降的内酰胺酶；质粒介导AmpC酶；水解碳青霉烯类的内酰胺酶。,四类酶的初步区别,CLAV CLOX EDTA广谱、超广谱酶 耐抑制剂广谱酶 AmpC酶 金属酶 ,超广谱-内酰胺酶(ESBLs),TEM：202种SHV：189种CTX-M：160种OXA：420种（19为ESBL）,15,我国主要流行CTX-M 型酶, 主要是CTX-M-14 和CTX-M-3。北美主要流行TEM 型ESBL。,2017/12/22,ESBL的检测方法,Initial Screen TestFor K. pneumoniae, K. oxytoca,and E. coli:Cefpodoxime zone 17 mmCeftazidime zone 22 mmAztreonam zone 27 mmCefotaxime zone 27 mmCeftriaxone zone 25 mmFor P. mirabilis:Cefpodoxime zone 22 mmCeftazidime zone 22 mmCefotaxime zone 27 mmPhenotypic Confirmatory Test等电聚焦电泳:PCR核酸序列分析,16,2017/12/22,肠杆菌科细菌对头孢菌素类敏感性折点,部分头孢菌素的新折点和报告的原则,2009年前的折点是在25年前建立的（那时还没有ESBLs）细菌对新旧-内酰胺类抗生素的耐药性和耐药机制在变迁和发展中，人类对其的认识逐渐深刻临床药理学科的发展，PK/PD对治疗效果决定作用临床医生需要“最佳治疗方案” 为了在目前的用药方式和用药剂量的情况下，能更好地预示抗菌药物在对抗感染治疗中所起的作用,2017/12/22,18,现在我们对检测ESBLs理解,ESBL表型试验不是最佳的在确证试验中，多重耐药机制的存在可能会掩饰ESBLESBL + AmpCESBL + 孔蛋白突变除大肠杆菌，克雷伯菌和奇异变形杆菌外，肠杆菌科其它细菌中也存在ESBLs ，这使确证实验更加不可靠在有些实验室不能实施MIC与“预后”的相关性优于“耐药”机制,2017/12/22,19,CLSI 对肠杆菌科细菌的ESBL检测和报告的建议,2017/12/22,20,使用新折点的报告原则：,没有必要进行ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病人治疗 采用纸片扩散法的临床实验室即可采用新的折点向临床报告药敏结果在商品化药敏系统 中目前受到限制，需要修改软件系统中的折点，并需进行实验室内验证新的折点适用于美国FDA批准的给药方案，各医疗机构的药物剂量和药物调整政策需要重新评估，以保证与CLSI推荐折点相一致。要让感染科的医师、药师、医院感染控制委员会的医师临床微生物实验室的技术人员了解和学习新折点，并通过他们教育其他医务人员,New!,2017/12/22,21,新折点和ESBLs的关系,不是所有的产ESBLs酶的菌株使用新折点时均被检测为耐药关注的是抗菌药物的MIC和药代动力学，而不是耐药机制抗菌药物的MIC是产酶菌株感染治疗预后的最佳指标采用新折点时，假如一株产ESBLs的菌株对头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松敏感，则不需要将“敏感” 修改为“耐药”,2017/12/22,22,AmpC酶,是由革兰阴性细菌(肠杆菌科细菌,铜绿假单胞菌等)的染色体或质粒介导产生的一类内酰胺酶，属Bush分类（底物谱分类法）Group 1，Ambler分类（分子结构分类法）Class C首选作用底物是头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制, 因此在国内又称作头孢菌素酶。因可被某些内酰胺类抗生素诱导产生,又称诱导酶。,2017/12/22,23,AmpC酶生化特性,相对分子量(Mr)介于38-42 KDa。灭活-内酰胺酶抑制剂，如对克拉维酸等不敏感.正在研究开发的硼酸类抑制剂 BRL42715、 RO48-1265、RO48-1220对其有较强的抑制作用。,2017/12/22,24,AmpC酶生化特性,对青霉素类抗生素除氮脒青霉素（美西林）或脒基青霉素（替莫西林）外均耐药。对多种三代头孢菌素和单环类抗生素耐药。对头霉素类耐药。对第四代头孢菌素一般表现为敏感。对碳青霉烯类抗生素敏感。但细菌高产AmpC酶结合外膜孔蛋白缺失可导致对其耐药。,2017/12/22,25,产ESBL与AmpC的耐药谱差别,ESBL AmpC 耐药谱多重 多重对三代头孢多耐药 耐药头孢吡肟多敏感 敏感哌酮/舒巴坦大多敏感 耐药哌拉/他唑巴坦大多敏感 耐药头霉素大多敏感 耐药碳青霉烯类敏感 敏感,2017/12/22,26,AmpC酶的基因构成,由5个不连锁基因即 ampC、ampR、ampD、ampE 和ampG组成ampC是AmpC酶的结构基因，编码产生AmpC酶蛋白基因ampR、ampD、ampE、ampG 是AmpC酶的调节基因，参与调控AmpC酶的合成过程。,2017/12/22,27,AmpC酶的基因构成,ampR是AmpC的转录调节因子，属于LysR调节子家族。AmpR在非诱导状态下作为ampC转录的抑制因子，而在诱导状态下作为转录激活因子存在。ampD是AmpC表达的负调控基因，位于远处染色体上，参与肽聚糖代谢。ampD的基因序列与AmpC酶的表现型密切相关。,2017/12/22,28,AmpC酶的基因构成,AmpE蛋白充当一个感受器，协助ampD完成对ampC的阻遏作用，在整个调节系统中居次要地位。 ampG编码转膜蛋白AmpG,具有透性酶活性，感受肽聚糖量的变化，在AmpC酶的表达中起着向胞浆内传递诱导信号的作用。,2017/12/22,29,染色体AmpC酶表达类型,（1）诱导高产型: 低基础水平和高诱导产生（2）持续高产型: 高基础水平持续表达， 亦称：稳定的去阻遏表达型（3）持续低产型: 低基础水平持续表达,2017/12/22,30,（1）诱导高产型,当有诱导作用的内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC酶的产量明显增加,增加的范围在1001000倍之间。,2017/12/22,31,轻 中 高青霉素类： 羧苄西林 替卡西林 哌拉西林 阿洛西林头孢菌素类： 头孢唑啉 头孢西丁 头孢噻肟 头孢哌酮 头孢曲松 头孢他啶碳青霉烯类： 亚胺培南-内酰胺酶抑制剂：克拉维酸 舒巴坦 他唑巴坦,各种抗生素对AmpC酶的诱导能力：,（2）持续高产型,原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD基因发生突变,产生有缺陷的AmpD蛋白,不能与AmpR调控蛋白结合形成复合物,AmpR蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。,2017/12/22,33,（3) 持续低产型,部分产AmpC酶的菌株持续低水平的产生AmpC酶,其原因可能是缺乏ampR基因或ampR基因发生突变,产生有缺陷的AmpR蛋白,不能在无内酰胺类存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有内酰胺类存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC酶得以持续低水平表达。,2017/12/22,34,染色体型 质粒,20世纪90年代前，为染色体型。90年代后发现质粒型，呈持续高表达,并在同种和 不同种细菌间水平播散，造成更严重的耐药性。质粒型AmpC种类在不断增加，目前已达130余种。产质粒型AmpC酶细菌：没有或具有不健全AmpC染色体的细菌种属具有健全AmpC染色体的细菌。,2017/12/22,35,质粒AmpC酶种类,CMY：121种ACT：37种DHA：23种MIR：18种FOX：12种MOX：11种ACC：6种,36,质粒AmpC酶流行背景,1989年Bauenfeind等报道了质粒AmpC酶CMY-1， 但没有提供其生化特征。第一个公认的质粒AmpC酶是1988年在美国普罗维登斯一家医院由Papanicolaou等从肺炎克雷伯菌中发现的MIR-1。从此以每年发现13个新质粒的速度增加。,2017/12/22,37,2017/12/22,38,2017/12/22,39,质粒AmpC酶的世界流行状况,2017/12/22,40,我国pAmpC酶的检测状况,2017/12/22,41,pAmpC酶的来源,系统进化树研究表明：pAmpC酶和某些菌属的染色体AmpC酶有着高度的同源关系。根据和不同菌属的染色体AmpC酶的同源关系，pAmpC酶可分为以下5组：,2017/12/22,42,pAmpC酶的分类,2017/12/22,43,pAmpC酶的来源途径推测,推测质粒介导的AmpC酶基因是来源于染色体的，目前大量的线索表明可能是通过整合子实现的。整合子(Integron)是近来新发现的能将耐药基因传递给其他细菌同时还能接受其他细菌的耐药基因，是细菌遗传进化天然克隆和表达系统。,2017/12/22,44,AmpC酶的检测方法,表型检测基因检测pAmpC酶确认需分两步: (1) 明确是否为高产AmpC酶 (2) 是否为质粒介导: 通过质粒接合实 验、Southern杂交证实,2017/12/22,45,AmpC酶的检测方法,表型检测方法: 头孢西丁敏感实验 头孢西丁三维试验,2017/12/22,46,头孢西丁敏感试验,操作：按CLSI标准操作判断：K-B法16g/ml为 耐药 意义：耐FOX的菌株有可能产生AmpC酶缺点：特异性差,2017/12/22,47,头孢西丁三维试验,将0.5麦氏单位大肠埃希菌ATCC25922菌液涂布于M-H平板上，取30g头孢西丁纸片置于平皿中心，用刀片在离纸片边缘5mm处放射状地由里向外切割一道狭缝，取40微升受试菌酶粗提取物由里向外加入狭缝内，尽量避免酶液溢出狭缝。将MH平板放入35孵箱过夜。,2017/12/22,48,头孢西丁三维试验,结果判断： 出现ATCC25922箭头样生长， 为三维试验阳性。 是目前公认的检测 高产AmpC酶的经典方法。,2017/12/22,49,AmpC酶的检测方法,基因检测法: 1 聚合酶链反应(PCR) 2 核酸杂交(Southern blot) 3 核苷酸序列分析法:是诊断最可靠和发 现新酶的方法,2017/12/22,50,AmpC酶的检测方法,方法虽多，但至目前CLSI仍未制定临床筛选AmpC酶的标准，随着产AmpC酶的革兰阴性杆菌引起的耐药性在临床上越来越受到重视，需要建立一种快速、简便的方法常规筛选AmpC酶，任务任重而道远。,2017/12/22,51,新折点和AmpC的关系,不是所有的产AmpC酶的菌株使用新修订的折点时均被检测为耐药大多肠杆菌科细菌均低水平产染色体介导的AmpC酶，头孢菌素对其的MIC较低，并处于敏感范围(新折点)AmpC酶介导的耐药是因为产高水平AmpC酶的突变株(去阻遏突变体) ,可灭活头孢菌素继而导致细菌耐药头孢吡肟是不容易被AmpC酶灭活药敏报告应与药敏结果一致，不需要修改CLSI不推荐AmpC酶的检测试验以进行治疗决策,2017/12/22,52,碳青酶烯酶,碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类内酰胺酶,它包括Ambler分子分类为A、B、D三类酶,2017/12/22,53,碳青霉烯酶的分类,注：a：+，强水解（kcat2s-1）；+-，弱水解（0.5 s-1kcat2s-1）；-，不水解（kcat90%），可能是KPC-1与这3种酶不是由同一基因分化而来,Antimicrob Agents Chemother. 2001 Apr;45(4):1151-61.,2017/12/22,57,KPC酶亚型不断增多,KPC-3和KPC-2相比有1个碱基的改变；以后的文献又陆续报道了多种酶，目前已达21种；,2017/12/22,58,KPC酶,据文献报道，KPC酶都需要合并膜孔蛋白OmpK35的缺失,引起细菌对碳青霉烯类药物耐药,2017/12/22,59,KPC酶的传播,KPC酶的传播机制还不是完全清楚有限的DNA指纹和脉冲凝胶电泳资料显示与医院感染有关。最早在美国、特别在美国的东北部各州蔓延，并造成局部地区暴发流行。以后几年再世界各地都有报告。,2017/12/22,60,KPC酶的传播,研究认为，blaKPC位于一种新型的Tn3型的转座子Tn4401上，其转座子的结构是KPC基因转移的原因这种新型的转座子结构可以使blaKPC从其原始位置转移至各类不同的质粒同时认为转座子Tn4401是一个复合转座子，由2次序列插入形成,2017/12/22,61,KPC酶的传播,Iskpn6位于blaKPc下游，Iskpn7位于blaKPc上游， ISKpn6和ISKpn7可能编码转移酶tnpA和tnpR分别编码转移酶IRL和IRR有39bp构成最外面的靶位复制点 （TSD）由5-bp ATTGA组成,2017/12/22,62,肠杆菌科细菌中的KPC,铜绿假单胞菌 哥伦比亚 &波多黎各,2017/12/22,63,实验室检测产KPC菌株,问题:1)一些菌株表现为低水平的碳氢酶烯类抗生素耐药，甚至敏感2) 有些自动化系统尚不能发现低水平耐药,2017/12/22,64,肠杆菌科细菌对碳青霉烯类敏感性折点的修订,实验室当前的工作,厄他培南是检测KPC酶的最佳底物建议将厄他培南列为常规药敏试验的品种对所有具有ESBLs/AmpC酶样表型（即对第三、第四代头孢菌素耐药）的肠杆菌科细菌都要怀疑产KPC酶，最好进行Hodge试验,2017/12/22,66,KPC酶的检测方法,采用改良的Hodge试验，PCR直接检测KPC酶的基因。,2017/12/22,67,改良Hodge试验,0.5麦氏浊度单位大肠埃希菌 ATCC25922涂布MH平板中间贴亚胺培南（10g）纸片接种待检菌的无菌接种环自 纸片外缘向平板边缘划线35过夜培养结果判断：亚胺培南抑菌圈内出现待检菌矢状生长者为产碳青霉烯酶 菌株,2017/12/22,68,改良Hodge试验存在的问题,肠杆菌科细菌：特异性和敏感性均90%;MHT阳性：不意味一定是产碳青霉烯酶；MHT阴性：不意味一定不产碳青霉烯酶；NDM型：敏感性较低（仅11%）；非发酵菌：不适用；变形杆菌、普罗威登斯菌和摩根菌：可以通过其他机制提高亚胺培南的MIC值，因此亚胺培南MIC筛选试验不适用于该3种菌属；,69,MHT阳性结果 如何报告？,如果发现菌株MHT试验结果阳性，是否应该将碳氢酶烯类抗生素敏感的结果改为耐药?CLSI建议：报告MIC值，但不报告“S”或者报告“R”、“I” 任选其一,2017/12/22,70,产NDM-1细菌,产NDM-1细菌：全称“产型新德里金属-内酰胺酶（New Delhi Metallo-lactamase 1, NDM-1）肠杆菌科细菌”，简称“产NDM-1细菌”，是一种对多种抗菌药物广泛耐药的细菌，主要为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌；特点：属于肠杆菌科细菌，致病力与普通肠杆菌科细菌没有差别；由于产生NDM-1导致广泛耐药，为“泛耐药菌”；主要导致医院感染；源于南亚地区，已在全球播散。,2017/12/22,71,为什么需要关注产NDM-1细菌,泛耐药导致的治疗挑战；多种肠杆菌科细菌发现；快速从南亚地区传播到欧美国家；不仅在医院感染这种发现，同时社区感染这种发现。,2017/12/22,72,产NDM-1细菌的发现,2008年在一位印度裔瑞典尿路感染患者中发现对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌，该菌对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，对环丙沙星也不敏感，仅对多粘菌素E敏感；该患者有多年糖尿病和中风史，经常往返于印度和瑞典之间，此前4月曾因臀部脓肿在印度住院治疗，其后回到瑞典，因尿路感染再度入院；这株细菌携带一种新型金属-内酰胺酶，研究人员根据患者感染地命名这种酶为NDM-1。,2017/12/22,73,全球产NDM-1细菌流行情况,2017/12/22,74,产NDM-1细菌种类,2017/12/22,75,实验室诊断,产NDM-1细菌感染临床表现与敏感菌没有差异，临床诊断困难；对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能；诊断主要依据实验室检查结果；实验室检查分为三步： 表型筛查-表型确认-基因确证,2017/12/22,76,产NDM-1细菌表型筛查,美罗培南或亚胺培南纸片法（K-B法，10g纸片）或最低抑菌浓度（MIC）测定法对肠杆菌科细菌进行初步筛查，达到以下标准，需进行表型确认。 K-B法：美罗培南或亚胺培南抑菌圈直径22mm。MIC测定法：美罗培南MIC2mg/L；或亚胺培南对大肠埃希菌、克雷伯菌属、沙门菌属和肠杆菌属MIC2mg/L。,亚胺培南,美罗培南,亚胺培南,美罗培南,2017/12/22,77,产NDM-1细菌表型确认,双纸片协同试验:采用亚胺培南(10g)、EDTA（1500 g） 两种纸片进行K-B法，两纸片距离10-15mm，在含EDTA纸片方向处，亚胺培南抑菌圈扩大，即可判定产金属酶。,2017/12/22,78,产NDM-1细菌表型确认,采用亚胺培南（美罗培南）/EDTA复合纸片进行K-B法药敏试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值5mm；亚胺培南（美罗培南）/EDTA 复合E试条协同试验测定MIC，单药与复合制剂的MIC比值8;即可判定产金属酶。,2017/12/22,79,产NDM-1细菌基因确证,采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序。,PCR,测序,各医院对阳性结果须加以复核，同时菌株送有条件参考实验室进一步检测确证。,2017/12/22,80,D类酶 （OXA酶）在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林的水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南的水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其他菌种转移的能力,碳青霉烯类抗生素水解酶,Class D -Lactamases,82,AAC, 2010, p. 2438,Dendrogram of precursor OXA-type carbapenemases.,Walther-Rasmussen J , Hiby N J. Antimicrob. Chemother. 2006;57:373-383, The Author 2006. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For Permissions, please e-mail: ,2017/12/22,83,关于插入序列,blaOXA酶的水解活性比较弱，研究发现在blaOXA基因的上游通常有段插入序列，可以增强OXA基因的表达。插入序列：ISAbaI、ISAba4、IS26ISAba2 blaOXA-58ISAba3模块、IS26、ISAba2、ISAba3。通常仅在CRAB中可以检测到这些插入序列中的一种或几种,而在敏感菌株中，这些插入序列通常缺失。这些插入序列可能含有目的基因的启动子，能够促进目的基因的表达。,84,2017/12/22,85,MBLS表型筛选和基因检测,图1：EDTA协同试验（EDTA纸片：100 mmol/L，5 l/片）图2：Etest试验结果图3： VIM-2型金属酶PCR结果电泳图,图1,图2,2017/12/22,我们的研究：,141株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌经EDTA协同试验及Etest ，结果仅4株（2.8%）阳性。其余菌株均为EDTA协同试验阴性。4株产金属酶菌株：均带有类整合酶基因，、类阴性。,86,4株菌类整合子结构,87,耐碳青霉烯菌株的碳青霉烯酶基因分型,沈继录，朱德妹。中华检验医学杂志 2008; 31(4): 408-414,2017/12/22,88,碳青霉烯酶检测的新技术： MALDI-TOF MS,国外最新报道有德国学者Irene等利用MALDI-TOF MS检测厄他培南降解产物来确定碳青霉烯酶的产生，此法可以检测产NDM-1、VIM-1、VIM-2 、KPC-2和IMP各型携带菌株捷克学者利用MALDI-TOF MS技术检测肠杆菌和铜绿假单胞菌共124株菌包括30株产碳青霉烯酶菌株，发现此法检测碳青霉烯酶的敏感性为96.67%，特异性为97.87%，证明了MALDI-TOF MS可以作为肠杆菌及铜绿假单胞菌中产碳青霉烯酶的实验室常规检测方法,Irene Burckhardt,Stefan Zimmermann.Using MALDI-TOF Mass Spectrometry to detect carbapenem resistance within one to two and a half hoursJ.J. Clin.Microbiol.2011Jaroslav Hrabak, Radka Walkova, Vendula tudentova, et al. Carbapenemase Activity Detection by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) Mass SpectrometryJ. J. Clin.Microbiol.2011,2017/12/22,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱,89,2017/12/22,90,2017/12/22,我们的研究,利用质谱技术检测内酰胺酶研究结果：ESBL，KPC、VIM、IMP均可得到较为满意的结果。 （尚未正式发表）。优点：由于只检测酶蛋白，减少了其他机制的干扰。缺点：蛋白含量有时较低,91,仪器：Check-MDR CT103 array test (Check-Points, Wageningen, The Netherlands结果：所有CTX-M基因均能被正确分类 (如：CTX-M-1 group, CTX-M-2 group, CTX-M-9 group and CTX-M-8/25/26 group). 质粒AmpC酶和碳青酶烯酶也均能检出,灵敏度和特异性100%,92,Evaluation of a DNA microarray for the rapid detection of ESBLs(TEM, SHV and CTX-M), plasmid-mediated cephalosporinases (CMY-2-like, DHA, FOX, ACC-1, ACT/MIR and CMY-1-like/MOX) and carbapenemases (KPC,OXA-48, VIM, IMP and NDM).,2017/12/22,氯霉素乙酰转移酶机制：将氯霉素乙酰化，使其不能与细菌50S核糖体亚基结合而失去抗菌活性。由细菌质粒或染色体基因编码，能在大肠杆菌中稳定表达,红霉素酯化酶机制：此酶是一种体质酶，由质粒介导，主要作用是水解红霉素及大环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去抗菌活性。,氨基糖苷类钝化酶分为： 磷酸转移酶（APH） 乙酰转移酶（AAC） 核苷转移酶（ANT）氨基糖苷类钝化酶作用机制： 三者分别使抗生素的羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体30S亚基结合。,氨基糖苷类耐药,庆大霉素高水平耐药（HLGR ） 主要的耐药机制 氨基糖苷类修饰酶 耐药基因 百分率 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia aac(6)-Ie-aph(2)-Ia 90% APH(2)-Ic aph(2)-Ic APH(2)-Id aph(2)-Id APH(2)-Ib aph(2)-Ib,10%,氨基糖苷类耐药,10%,8,724bp,ORF1,ORF2,ORF4,ORF3,5,3,ISEcp1 (tnpA),aph-Ie,repD,str部分序列,一种新的质粒介导的肠球菌氨基糖苷类耐药基因aph(2”)-Ie,aac(6)-Ib-cr介导的喹喏酮类新耐药机制,2006年所报道的喹诺酮类修饰酶介导的对部份喹诺酮类药物的耐药性显然是耐药机制的重要发现之一。Hooper的实验小组发现变异的AAC（6）-Ib-cr氨基糖苷乙酰转移酶具有了更广的底物范围，能修饰灭活氨基糖苷类和喹诺酮类两类化学母体结构各异的药物，但该酶对氨基糖苷类的乙酰化作用仍强于喹诺酮类。,这种变异酶是AAC（6）-Ib仅发生Trp102Arg和Asp179Tyr两个氨基酸残基改变，介导了对诺氟沙星和环丙沙星的耐药性（MIC增加24倍）。对313株耐环丙沙星（MIC0.25g/ml）及降低了对头孢他啶敏感性的肠道杆菌（主要为大肠埃希菌）分析，发现一半的受检测菌株存在aac（6）-Ib基因，其中有28%产生变异的AAC（6）-Ib-cr，并导致了对环丙沙星的低程度耐药。喹诺酮类系全合成药物，其修饰酶的发现具有重要的临床意义，aac（6）-Ib的变异基因已有30种以上，设计新型喹诺酮药物应该考虑到潜在的酶修饰灭活机制。,16S rRNA甲基化酶,氨基糖苷类抗生素作用位点：细菌16S rRNA以往认为最重要的氨基糖苷类抗生素耐药机制：修饰酶，作用位点在药物，引起一种或几种药物耐药2002最新发现一类新的氨基糖苷类抗生素耐药机制： 16S rRNA甲基化酶，引起药物作用位点的甲基化，导致细菌对所有氨基糖苷类抗生素高水平耐药，目前发现4种：armA、rmtA、rmtB、rmtC多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行，该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率和耐药水平高16S rRNA甲基化酶是否在介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究,二、细菌药物作用靶位改变,由于抗菌药作用的靶位发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法结合或亲和力下降，这种耐药机制在细菌耐药中普遍存在。,主要有两种方式：改变细菌靶蛋白 抗生素结合位点的蛋白质结构发生改变或被修饰，均可导致亲和力的降低产生新的靶位 细菌遗传物质变异产生新的低亲和力蛋白酶，替代原先途径，拮抗抗菌药物作用,-内酰胺类: 青霉素结合蛋白(PBP),氨基糖苷类： 核糖体30 S亚基四环素类： 核糖体30 S亚基大环内酯类： 核糖体50 S亚基氯霉素： 核糖体50 S亚基克林霉素： 核糖体50 S亚基，利福霉素类： 依赖于DNA的RNA聚合酶喹诺酮类： DNA促旋酶磺胺类： 二氢碟酸合成酶和二氢叶酸还原酶万古霉素： 细胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的 游离羧基。,主要抗菌药物作用靶位,青霉素结合蛋白（PBPs）,占细菌全部膜蛋白的1多数存在内膜中不同细菌内膜所含PBPs数目不等，一种细菌常含4-8种PBPs。 肠杆菌属：6-8个 肺炎链球菌、化脓性链球菌：5个 金葡菌：5个 淋球菌：3个 流感杆菌：8个,PBP2a的作用,PBP2a与-内酰胺抗生素亲和力低，替代正常PBP功能 87KdaPBP1合成细菌细胞壁肽聚糖 80 PBP2细菌处于非生长状态的转肽酶 78 PBP2a编码PBP2a基因为mecA 75 PBP3 70 PBP3与细菌分裂有关的转肽酶 41 PBP4在粘肽二级交联过程中具有转肽酶和羧肽酶的双重活性,大环内酯类的耐药机制,核糖体靶位点的改变: erm 编码，高耐; 法国、西班牙、中国主动外排泵: mef 编码，低耐 ，加拿大、美国、修饰酶,喹诺酮类药物的作用靶位,在细菌细胞内，喹诺酮类药物的作用靶位是型拓扑异构酶（DNA促旋酶和拓扑异构酶）。DNA促旋酶是由2个A亚基和2个B亚基组成的四聚体，催化依赖于ATP的DNA负超螺旋，在DNA复制和转录阶段起重要作用。A亚基由gyrA编码，负责DNA的断裂和重接;B亚基由gyrB编码，催化ATP的水解。哇诺酮类药物通过与促旋酶一DNA复合体相结合而抑制DNA的断裂一重接循环。拓扑异构酶为2个C亚基和2个E亚基组成的四聚体，在DNA复制后期姊妹染色体的分离过程中起重要作用。C亚基由parC编码，负责DNA的断裂和重接，E亚基由parE编码，催化ATP的水解。,靶位基因的突变,DN A 促旋酶和拓扑异构酶N都是细菌细胞生长所必需的酶，其受到抑制将导致细胞死亡。编码这两种酶的基因发生点突变，导致密码子的改变，或引人终止密码子不能产生完整的酶亚基;或形成编码另一氨基酸的密码子，使所编码的酶亚基发生氨基酸取代，影响到喹诺酮类药物与靶位的结合，从而影响细菌对喹诺酮类药物的敏感性及耐药性的出现。,DNA促旋酶基因和拓扑异构酶基因的突变都与喹诺酮类耐药性有一定的相关性.已观 察 到 的GyrA突变所致GyrA氨基酸取代有: Ser83 LeuAsp87 Gly,Tyr,Asn,His.Gly81 Asp.Ala84 Val. Asp678 Glu. parC突变所致ParC氨基酸取代有: G1y78 Asp Ser80 Lle ,Arg. Glu84 Lys. Val253 ILe.1Le228 Val.Gly435 Ala.His584 Tyr.Asp583 Gly; gyrB突变所致的GyrB氨基酸取代仅观察到Lys447 Glu，未发现parE能引起ParE氨基酸取代的突变。,三、细菌细胞膜渗透性改变,革兰阴性菌细胞壁的外膜上有脂多糖，孔蛋白等通透性低，是一种有效的屏障，不仅使细菌不易受到机体杀菌物质的作用，还可阻止某些抗菌药的进入，是细菌耐药的机制之一 这种耐药是非特异性的，主要见于阴性细菌中,而在革兰阳性菌中细胞膜被一层厚厚的肽聚糖细胞壁所包裹。尽管细胞壁具有很强的机械强度，但由于其结构比较粗糙，几乎不影响抗菌药物这样的小分子物质扩散至细胞内。,膜通透性屏障相关基因突变,大量研究表明，可引起膜通透性降低的基因突变在革兰阴性菌中广泛存在已在氟哇诺酮耐药性大肠埃希菌的染色体上发现norB, norC,nfxB,nfx C和cfxB等多个影响药物在细菌体内蓄积的染色体突变基因。携带这些突变基因的耐药菌株几乎都具有共同的表型-Omp的异常，尤其是作为亲水性小分子药物通道的OmpF减少或缺失;细菌除对氟唆诺酮类药物的摄人减少外，对其它小分子亲水性药物，如R-内酸胺类抗生素、四环素和氯霉素等也发生交叉耐药。OmpF减少或缺失是细菌膜通透性降低的主要因素。,我们的研究耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌膜蛋白质组学研究,膜蛋白的提取和分离:双向凝胶电泳(2-DE)和图像分析：质谱分析：肽质量指纹图谱数据库构建:,113,研究结果,114,敏感株和耐药株的差异膜蛋白图谱有4个外膜蛋白，在耐药菌中OmpW外膜蛋白表达下调，推测的相对分子量为22103外膜蛋白、碳青霉烯类耐药相关蛋白（CarO)和OmpA外膜蛋白表达缺失；另有1个推测的相对分子量为41103的保守外排泵蛋白在耐药菌株中表达上调。,115,一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。 亚胺培南是一种非典型的-内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。,“后天获得”,外膜孔蛋白减少或丢失,细胞内抗生素浓度降低膜孔蛋白(OprD):,118,我们的研究 耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌外膜蛋白机制研究,（一）PCR扩增检测oprD2基因,引物设计思路oprD2 常见的缺失突变有2 种小片段缺失：编码区395405 位11 bp大片段缺失：启动子上游519 位到编码区685 位的1204 bpPCR 扩增预期有2 种结果: 阳性结果：正常序列小片段缺失碱基突变基因插入 PCR产物需要进一步DNA测序分析阴性结果：大片段缺失,（二） SDS-PAGE分析膜蛋白OprD2的相对含量,119,34株(24.1%)PCR阴性，示oprD有大片段缺失6株(4.3%)显示有PCR扩增片段大于预期1332bp(2184bp)，测序分析发现均由一片段插入(IS 852bp/1350bp)oprD2编码基因96株均有小片段缺失或不同位置的多点突变4株VIM2型金属酶产生株及1株IMPSMEMR未发现异常,结果,141株耐药株oprD2编码基因序列分析结果,120,突变位点,121,18株PA外膜蛋白编码基因及OprD2蛋白相对定量结果,结果,Adapted with permission from Livermore DM. Clin Infect Dis 2002;34:634-640.,Efflux System Pump (Mex B),MexABOprM （1993）MexCDOprJ （1996）MexEFOprN （1997）MexXYOprM （1999）MexJKOprM （2002）MexGHIOpmD（2002）,外排泵的基本组成：内膜转运蛋白外膜通道蛋白融合蛋白,四、药物主动外排系统,使抗菌药物外排，降低细菌细胞内的药物浓度而耐药，而且是导致多重耐药的重要机制目前研究表明主要有两大类外排系统：特异性（单一性）外排系统和多种药物耐药性（multidrug resistance，MDR）外排系统。,多重耐药系统 主动泵出活动增强和外排药物通透性下降的协同作用。 例如：铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM表达增强和OprD2的缺失，对亚胺培南耐药 特点：结构上无关的多重抗生素耐药，但是对氨基糖苷类敏感，多见于大肠埃希菌，铜绿假单胞菌。,125,截止到目前，在铜绿假单胞菌中已经报道了12种RND型外排泵系统，分别命名为MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY、 MexJK、MexGHI-OpmD、MexVW-OprM、CzcCBA、TriABC-OpmH、MuxABC-OpmB、MexPQ-OpmE和MexMN-OprM。此外最近也有报道在铜绿假单胞菌中发现了MATE家族的外排泵系统PmpM。 这些过度表达的外排泵常常导致对3种以上的抗生素，消毒剂（杀虫剂）染料及去污剂耐药，其中主要包括：喹诺酮类（萘啶酸、环丙沙星和诺氟沙星）四环素、氯霉素、乙啡啶、吖啶黄(消毒灭菌剂) 、十二烷基硫酸钠、 三重氢核 X-100、三氯森、有机溶剂。,染色体突变：,gyrA,gyrB,parC,parE,质粒介导：,喹诺酮类药物耐药基因-质粒介导的外排泵机制,qnrA,qnrB,qnrC,qnrS,QepA,AAC（6）-Ib-cr,qnrD,如以美罗培南的MIC值下降4倍为判断标准，141株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中约有69.1%(65/94)的菌株具有外排泵机制。,泵抑制剂MC207110对美罗培南的抗菌作用影响,我们的研究外排泵介导的亚胺培南耐药新机制,128,抑制剂PAN对74株多重耐药鲍曼不动杆菌MIC的影响,129,外排泵高表达的20株铜绿假单胞菌的外排泵基因（MexA、MexC、MexE、MexX）mRNA表达水平的Realtime PCR检测，结果显示4种外排泵基因mRNA表达水平均有增高。其中以MexEF-OprN为最多，共有10株。其次，为MexCDoprJ，有5株。MexXY-OprM最少，只有3株。,Real-time PCR检测 20株铜绿假单胞菌4种外排泵基因结果,结果,130,外排泵编码基因的调控基因序列分析结果：,结果,20株菌株编码基因（ MexB、MexD、Mex