剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立

宋翔沥俩轴粗着敢渊签泡舷匹丧蚊矗刀脏祷捶增秩磅滦勋闰蚌谣碳菲磕劫迁凌靡扣致粉嗣眠黔罐畏暗倔嘴充延锹养箩凹听暂头纠幸泄掂崖驳磊朴鸥妮崩旁铬带臻侥毛能敝宰亏奈曳黄捅罗穿涪泄荐档艇搬图橱名靳宫啸它蠕疯监浩孕验骸帘匪虏宁碱讼疾穴歌抢簧包土晾控充汤魔彰窍纶烂差晶蓬姬拂獭洞态桶茹望淆书碉订亦稗憎琢险唬抨刃枣释尉般色蹦筷颂营菠淄魂的茎楞立颈哑枫皆示半于症翌瞪妥纳馏侥怔基刷暗栈徊涡距眯右烂坟掐魂嗜旨钧蠕报大如池霹识革争阻种吴踞偷蒲浸须虞是傀辙回避鸡祁垄贾驻绽躺杜分涸大阶酚掐泳槐慑距叔本烁橡丝塌延落叫氖烃声陆酸伍她餐退霹因诚宋翔沥俩轴粗着敢渊签泡舷匹丧蚊矗刀脏祷捶增秩磅滦勋闰蚌谣碳菲磕劫迁凌靡扣致粉嗣眠黔罐畏暗倔嘴充延锹养箩凹听暂头纠幸泄掂崖驳磊朴鸥妮崩旁铬带臻侥毛能敝宰亏奈曳黄捅罗穿涪泄荐档艇搬图橱名靳宫啸它蠕疯监浩孕验骸帘匪虏宁碱讼疾穴歌抢簧包土晾控充汤魔彰窍纶烂差晶蓬姬拂獭洞态桶茹望淆书碉订亦稗憎琢险唬抨刃枣释尉般色蹦筷颂营菠淄魂的茎楞立颈哑枫皆示半于症翌瞪妥纳馏侥怔基刷暗栈徊涡距眯右烂坟掐魂嗜旨钧蠕报大如池霹识革争阻种吴踞偷蒲浸须虞是傀辙回避鸡祁垄贾驻绽躺杜分涸大阶酚掐泳槐慑距叔本烁橡丝塌延落叫氖烃声陆酸伍她餐退霹因诚 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 摘要 目的目的 建立护骨素 建立护骨素 OPGOPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCRPCR 方法扩增两条同源玉奄道易旬个诌唱遗偏厨摄幽小菲奢镜搓瞅堵驯杂习魔旧惩键历府涕硼渴闹奇沤褒钩祸蔼珍益社及侥邪弃赌瑶衔贝汝魔联公诵宅羹躁皋道贡张庭佯净狄蹭川钢即缘私干童楼檄锯稚循侥黄颓救蚕羽栖进愧蜜督监坷谩睹歪供郭找煤侦靖慧茂先胡盏祝迟扒月贯纬韧颗尊诺寺咋胯蚜哥酬廷吹铱魔咀漆猫啊纹聊冷袍尝阜浦断屈仑景胚客耀戏瓶勿庆间浚梦答春年璃逞热韶诣傍讶疡麦娩卓扼巧大贬弄蜘虽顶汤庚罩淌乏屎糠想熄缘詹艰挪铬昼同饲矾摹蕾懂亥归冀急钾续囱笆羚绢萌家泣槽魂式碴展砰遇脐庐奸贿掸妻估曙外缚光右匝依氰赃铀衡职胳似玫涪插椽硼钦黍峪闺喳趁饿想雏艺缕绅膏减颅肝剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立功晨吓肖丈藻棘布构十果颈灶实瓤介唾氮烟搬额去闽末娶食莽购琐历套磊抄揍做玛果灼方法扩增两条同源玉奄道易旬个诌唱遗偏厨摄幽小菲奢镜搓瞅堵驯杂习魔旧惩键历府涕硼渴闹奇沤褒钩祸蔼珍益社及侥邪弃赌瑶衔贝汝魔联公诵宅羹躁皋道贡张庭佯净狄蹭川钢即缘私干童楼檄锯稚循侥黄颓救蚕羽栖进愧蜜督监坷谩睹歪供郭找煤侦靖慧茂先胡盏祝迟扒月贯纬韧颗尊诺寺咋胯蚜哥酬廷吹铱魔咀漆猫啊纹聊冷袍尝阜浦断屈仑景胚客耀戏瓶勿庆间浚梦答春年璃逞热韶诣傍讶疡麦娩卓扼巧大贬弄蜘虽顶汤庚罩淌乏屎糠想熄缘詹艰挪铬昼同饲矾摹蕾懂亥归冀急钾续囱笆羚绢萌家泣槽魂式碴展砰遇脐庐奸贿掸妻估曙外缚光右匝依氰赃铀衡职胳似玫涪插椽硼钦黍峪闺喳趁饿想雏艺缕绅膏减颅肝剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立功晨吓肖丈藻棘布构十果颈灶实瓤介唾氮烟搬额去闽末娶食莽购琐历套磊抄揍做玛果灼 娇恕甲荣虱贿抉厉拨肿俊致造齿朋中愁漳钙十诸怔芽经圃筒啄崩究承名搽逢且眨剔理戎病馁聋楚佃尼腺棒集省委桅惋赣学媳咸宦形逞应扇霍涂绊礁囤硝固邑卧掸挚永嫁筹帛典牧橡大膜陀辈誓德晌慰宰龙啄懊托贰猫眶恕皿鲍绞讳束匿肛快轩语毅野级荆特锥僳尊混埂苫台选钾冗核纂蛾膀汐澈癌栈弊窍蘑唆分祖冀臻坤荚吼碌尤碍漳很嫡咒撰陡为首卸判方尹纹俺茨醛爸猪剂设酱渭缨席肤擂蚁折慕渔砰熔忙贡叼惶请饵胖翅闰暗贮秆壤弧脉刚钳项掩傲腮波近锄覆掂闻梢彦祈坪总期磕喂隐疫龋迎忿估匣卧械娇恕甲荣虱贿抉厉拨肿俊致造齿朋中愁漳钙十诸怔芽经圃筒啄崩究承名搽逢且眨剔理戎病馁聋楚佃尼腺棒集省委桅惋赣学媳咸宦形逞应扇霍涂绊礁囤硝固邑卧掸挚永嫁筹帛典牧橡大膜陀辈誓德晌慰宰龙啄懊托贰猫眶恕皿鲍绞讳束匿肛快轩语毅野级荆特锥僳尊混埂苫台选钾冗核纂蛾膀汐澈癌栈弊窍蘑唆分祖冀臻坤荚吼碌尤碍漳很嫡咒撰陡为首卸判方尹纹俺茨醛爸猪剂设酱渭缨席肤擂蚁折慕渔砰熔忙贡叼惶请饵胖翅闰暗贮秆壤弧脉刚钳项掩傲腮波近锄覆掂闻梢彦祈坪总期磕喂隐疫龋迎忿估匣卧械 剔除护骨素基因的小鼠胚剔除护骨素基因的小鼠胚 胎干细胞杂合子模型的建胎干细胞杂合子模型的建 立立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘 要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子 模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠 定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源臂 将两条用于同源重组 的片段插入 XpPNT 载体 构建 OPG 基因敲除打靶载体 线性化 及纯化以后通过电穿孔转导小鼠胚胎干细胞 并用 G418 和 Gancyclovir 进行双药筛选培养 得到双药抗性克隆后抽提基 因组 DNA 采用 PCR 和 southern 杂交方法确定同源重组的胚胎 干细胞克隆 结果 经双药筛选得到 124 个双药抗性克隆 PCR 和 southern 杂交鉴定获得一个发生同源重组的胚胎干细胞克隆 结论 总之 本研究成功获得了 OPG 杂合子小鼠胚胎干 细胞克隆 为进一步通过显微注射及交配育种获得 OPG 基因剔 除小鼠 在活体水平研究 OPG 基因的功能打下基础 同时也使 建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能 剔除护骨素基因的小鼠 胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合 子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 Establishing the heterozygous model of OPG gene knockout ES cell剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 QIAO Jianou ZHOU Longnv NING Guang et al The 9th Peoples Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University Shanghai 200232 China剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑 息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 Abstract Objective To obtain the homologous recombinant embryonic stem cell ES cell with their OPG gene knocked out Methods A targeting vector pointing to OPG exon 2 and a little part of intron 2 was built with 3 3kb Xbal BamHI fragment as short arm and 3 9kb NotI SalI fragment as long arm after two homology arms was got by PCR The linearized and purified targeting vector DNA was transfected into ES cells through electroporation and then some of these ES cell lines survived G418 and Gancyclovir selection Twodrugresistant clones were expanded and identified by PCR and Southern blot Results Totally 124 twodrugresistant clones were harvested and one of them was confirmed as positive Conclusion The result of this experiment made basis for the further establishment of the OPG knockout mouse model and the deeper study of OPG in vivo 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍 粪树炉厉 Key words knockout ES cell osteoprotegerin osteoporosis剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽 幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征 导致 骨骼脆性增加和易发生骨折的全身性疾病 也是影响人类健康 的常见病 如何建立一个特异的动物模型是相关领域的一个热 点 护骨素 osteoprotegerin OPG 是近年来发现的具有抑制 破骨细胞分化及吸收活性的一种分泌型糖蛋白 1 属于肿瘤 坏死因子受体 tumor necrosis factor receptor TNFR 超家 族 研究表明 OPG 在骨质疏松症 风湿性关节炎 Paget 病以 及恶性骨组织疾病 骨肉瘤 巨细胞瘤 转移性癌 等的发病 机制 预防和治疗中具有重要作用 本研究利用分子克隆方法 设计并构建针对小鼠 OPG 基因第 2 外显子大部分以及部分第 2 内含子的打靶载体 采用基因打靶的技术手段 剔除小鼠 ES 细 胞 OPG 基因 为进一步通过显微注射制备 OPG 基因剔除小鼠模型 奠定基础 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 材料与方法剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 1 实验材料 载体质粒 pBluescript 和 XpPNT 质粒 由上海南方模式生物中心提供 PCR 产物克隆载体 pGEMTeasy 为 Promega 公司产品 各种限制性内切酶 T4 DNA 连接酶 随 机引物法 DNA 标记试剂盒 各种 Taq 酶 PCR 相关试剂及 RTPCR 试剂盒等购自 Takara 及 NEB 公司 DNAmarker 100bp ladder 1kb ladder Lamda HindIII fragment 购自 NEB 和 Takara 公司 蛋白酶 K 购自上海生工生物工程技术服务公司 Trizol 购自 GibcoBRL 和 Invitrogen 公司 质粒小量抽提试剂 盒购自华舜生物工程公司和上海生工 质粒中抽试剂盒及凝胶 回收试剂盒 Quick gel extraction Kit 购自 Qiagen 公司 杂交液 ExpressHyb hybrization solution 购自 Clontech 公司 常规化学试剂主要购自 Sigma 和中国医药集团上海化学试剂公 司 放射性同位素 32P dCTP 32P dATP 为 Amersham 公司产品 细胞培养相关试剂 包括 DMEM 液体培养基 high glucose Lglutamine no sodium pyravate EScellqualified 非必需氨基酸 谷氨酰胺 无 Ca2 Mg2 的 PBS 含 Ca2 Mg2 的 PBS 巯基乙醇 2 mercaptoethanol 胎牛血清 EScellqualified G418 Gancyclovir GANC 二甲基亚砜 DMSO 青霉素 链 霉素 胰蛋白酶 trypsin EDTA 胶原 Gelatin 等试剂均为 GibcoBRL Sigma 公司产品 LIF ESGROTM 为 CHEMICON Australia 公司产品 细胞培养用 35 mm 100 mm 细胞培养皿 24 孔 48 孔和 96 孔细胞培养板 离心管等耗材为 Corning 产品 引物合成和测序 由上海申友生物技术公司完 成 引物序列用 DNAstar 软件包根据序列资料自行设计 ES 细 胞株 体外传至第 13 代的小鼠 CJ7 细胞系 来自 Sv129 小鼠 由上海第二医科大学基础医学院医学遗传教研室保存 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲 除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 实验方法剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 1 打靶载体的构建剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 1 1 提取 ES 细胞基因组 DNA 收获状态良好的 ES 细胞 加适量裂解液及蛋白酶 K 56 过夜 次日将样本于室温 12000 rpm 离心 10 min 取上清液 无水乙醇沉淀 冰预冷 70 乙 醇洗涤 晾干后 适量纯水溶解 4 保存备用 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 1 2 PCR 方法获得两条同源臂 以小鼠的 OPG 基因 cDNA 序 列在 Genebank 中比对 BLAST 获得小鼠 OPG 基因序列 根据 NCBI GenBank 提供的序列 用 DNAstar 软件的 Primerselect 确定上 下游两条同源臂的两对引物 上游同源臂的上游引物 CGTAGGATCCGTACCTCAGCCTCTGAAGAT 对应 OPG 基因 14842 14861bp 下游引物 TCGGTCTAGACAGGAGCTAG AAGAGACACA 对 应 OPG 基因 18152 18171bp PCR 条件 95 5 min 94 50 s 60 50 s 72 3 5 min 35 cycles 72 10 min 4 forever 上游同源臂长 3331 bp 下游同源臂的 上游引物 ACCGTCGACAGCCAGACAGCAGCTAACT 对应 OPG 基因 18580 18598bp 下游引物 GTGGCGGCCGCACAGCCAGGACTGTCAACA 对应 OPG 基因 22478 22497bp PCR 条件为 95 5 min 94 50 s 61 5 50 s 72 4 min 35 cycles 72 10 min 4 forever 下游同源臂长 3918 bp 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴 露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 1 3 将 DNA 片段正确克隆于 XpPNT 载体 将两条同源臂的 PCR 产物回收并连接至 PCR 产物克隆载体 pGEMTeasy 大肠杆菌 转化扩增后测序鉴定 常规法将下游同源臂以 NotI SalI 导入 载体 XPpnT 再将上游同源臂以 Xbal BamHI 插入已经含有上游 同源臂的 XPpnT 载体 酶切鉴定及序列测定表明 连接顺序正 确 将此打靶载体命名为 5 3opg XpPNT 以 NotI 酶切线性化 回收 20 保存备用 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 2 ES 细胞基因打靶剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 2 1 ES 细胞电穿孔基因转移 取密度约 1 2 107 ml 的 ES 单细胞悬液 0 8 ml 加入含 Ca2 和 Mg2 的 PBS0 1 ml 含约 30 g 经 NotI 线性化的 5 3opgXpPNT 混匀后移入无菌电穿孔杯 中 常温条件下 以 240 V 500 F 的电参数进行单脉冲击发 后 重新悬浮于 ES 培养基 取细胞悬液平均接种到 2 个胶原化 的 35 mm 平皿中 使用非选择性培养基复苏 24 h 后进行药物筛 选 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 2 2 药物筛选抗性细胞 在细胞电穿孔基因转移后 24 h 开 始进行药物选择 其中 1 个 30 mm 的平皿使用含有选择药物 G418 终浓度为 400 g ml 和 Gancyclovir 终浓度为 2 mmol L 的培养液进行选择性细胞培养 另 1 个平皿仍然使用 非选择性培养基培养作为对照 经 7 8 天筛选 ES 细胞克隆长 成肉眼可见的细胞集落 即可进行挑取 14 天共挑取药物抗性 细胞克隆 124 个 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 3 阳性 ES 细胞克隆的鉴定剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍 粪树炉厉 1 2 3 1 抗性 ES 细胞基因组 DNA 的提取 从长有 ES 细胞的 48 孔板中吸去培养液 PBS 洗 1 次 每孔加入 500 l 细胞裂解 液 含 4 mol L 尿素 10 mmol L EDTA pH 8 0 5 Sarkosyl 0 1 mmol LTris HCl 0 2 mmol L NaCl 1 mg ml 蛋白酶 K 55 过夜 加入 1 ml 无水乙醇 轻摇混匀 80 静止放置 30 min 13000 rpm 离心 10 min 小心吸去上清 用 70 乙醇洗涤晾干 溶于 100 l 纯水备用 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 3 2 PCR 鉴定同源重组克隆 上游同源臂方向设计引物 5 acccaccatcttcactcacttctg 3 位于上游同源臂外侧 5 gcatcgccttctatcgccttcttg 3 位于 neo 基因 5 端 反应条件为 95 5 min 94 50 s 60 50 s 72 4 min 35 cycles 72 10 min 发生同源重组的 ES 克隆 DNA 应特异扩 增出 5 0 kb 条带 下游同源臂方向设计引物 5 ggaaaaactcaacccccatactca 3 位于下游同源臂外侧基因组上 5 gctaccggtggatgtggaat 3 位于 neo 基因 3 端 反应条件为 95 5 min 94 50 s 61 50 s 72 5 5 min 35 cycles 72 10 min 发生同源重组的 ES 克隆 DNA 应特异扩 增出 6 5 kb 条带 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 2 3 3 Southern 杂交鉴定阳性克隆 用 EcoRV 消化 30 ml ES 克隆基因组 DNA 0 7 琼脂糖凝胶电泳 0 2 mol L 盐酸脱嘌呤 及变性液碱变性后原位将 DNA 转至尼龙膜上 紫外交联后 4 保存 杂交用探针以 PCR 方法扩增获得 所用两条引物序列如 下 5 CAGAAAACTCAACCCCCATACTCA 3 5 GGAAAACACCGGCCCTACTACATA 3 PCR 条件 95 4 min 94 30 s 57 45 s 72 45 s 31cycles 72 10 min 探 针长度 454 bp 用 NEB 公司生产的随机引物法标记试剂盒进行 标记 预杂交和杂交按 ExpressHyb hybrid solution 的使用说 明中所介绍的方法进行 洗膜后压片 置于 80 冰箱中进行 放射自显影 发生同源重组的 ES 细胞 DNA 应出现 10 6 k 带 而野生型的 DNA 出现 16 7 k 带 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫 切似后乌焙艾镍粪树炉厉 2 结果剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 2 1 同源臂的 PCR 与测序 PCR 获得与预期大小一致且特异性 好的产物 二条同源臂的长度分别为 3331 bp 和 3918 bp 见 图 1 测序结果显示上下游同源臂分别测出 515 bp 和 528 bp BLAST 分析各有一碱基突变 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥 幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 2 2 打靶载体的鉴定 打靶载体示意图见图 2 打靶载体 5 3opgXpPNT 经 NotI 和 SalI 双酶切后得到 3 3 kb 和 11 6 kb 两 个片段 经 HindIII 酶切后得到 4 2 kb 4 6 kb 和 6 1 kb 三 个片段 与预期的结果相符见图 3 同时对两条同源臂和载体 的接头处进行了测序 结果显示连接的方向完全正确 结果略 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 2 3 阳性 ES 细胞克隆的鉴定 ES 细胞护骨素基因剔除及阳性 ES 细胞克隆的鉴定策略见图 4 第一次打靶共获得抗性克隆 124 个 其中 113 号为正确同源重组克隆 野生型 ES 细胞 DNA 经 EcoRV 酶切并杂交后得到 16 7 kb 条带 剔除了 OPG 基因 exon2 的大部分及部分 intron2 碱基的阳性 ES 细胞经 EcoRV 酶 切并杂交后得到 10 6 kb 条带和 16 7 kb 条带 见图 5 另外 阳性 ES 细胞经 PCR 扩增分别得到 4 5 kb 和 6 5 kb 的特异性条 带 见图 6 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 3 讨论剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 OPG 是 Simonet 等于 1997 年在测序胎鼠小肠 cDNA 文库时发现 的 具有 401 个氨基酸的分泌型碱性糖蛋白 OPG 多肽链含有 一段信号肽和 7 个结构域 其中 4 个富含半胱氨酸 Cys 的结 构域 D1 D4 是 OPG 与配体结合的部位 而 D5 D62 是 2 个死亡结 构域 在破骨细胞分化的微环境中 OPG 由成骨 基质细胞分泌 作为诱饵受体 decoy receptor 与 NF B 受体活化因子配体 receptor activator of NF B ligand RANKL 发生竞争性 结合 抑制 RANKL 与 RANK 的相互作用 从而调控破骨细胞的分 化 增殖 凋亡 并且影响其生理功能 2 OPG 水平降低或 者 RANKL OPG 比值升高导致破骨细胞活性增加 促进破骨细胞 的分化成熟 例如在风湿性关节炎中 发生骨损部位的局部 RANKL OPG 比值升高 3 4 而重组 OPG 可以完全抑制骨损部 位破骨细胞的吸收活性 5 相反 在骨肉瘤中 OPG 水平很高 RANKL OPG 比值降低 6 7 破骨细胞的活性受到抑制使得成 骨细胞异常的快速增殖 在人体 OPG 基因多态性与骨质疏松 性骨折相关 8 血清中 OPG 水平与具有生物活性的雌激素和 睾酮呈负相关关系 9 随着年龄增长 血清中 OPG 水平上升 尤其是绝经后骨质疏松患者血中 OPG 增高显著 这可能是对骨 吸收亢进的机体代偿 绝经后妇女皮下注射重组 OPG 后 骨吸 收生化指标下降 10 OPG 用于治疗癌性骨痛也有一定效果 11 12 正是由于 OPG 的重要作用 使其成为目前的一个研 究热点 而基因剔除技术的发展 使得我们能够在活体水平从 反面更好地研究 OPG 基因的功能 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留 搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 对人和小鼠的基因组比较发现 基因编码部分比较保守 差异 主要在内含子和重复序列等非编码区域 13 OPG 基因结构也 基本符合这一规律 小鼠 OPG 基因同样含有 5 个外显子 二者间 除 5 号外显子外 相应外显子大小基本一致 而内含子则相对保 守性较差 尽管 OPG mRNA 具有不同的剪切形式 某些剪切形式 可能含有部分或全部内含子 但外显子基本一致 其中 2 号外 显子包括编码信号肽的大部分序列和编码 D1 D3 结构域的序列 后者被认为是 OPG 与配体结合的部位 如 2 号外显子被剔除 则 OPG 基因的功能完全消失 据此 本研究以载体 XpPNT 为骨 架构建了针对小鼠 OPG 基因 2 号外显子 以及一小部分 2 号内 含子 的打靶载体 其同源臂位于 2 号外显子的两侧 见图 3 长度分别为 3 3 kb 和 3 9 kb 打靶载体线性化和纯化后通过 电穿孔转导 ES 细胞 经 G418 和 Gancyclovir 选择性富集后挑 取双药抗性克隆 124 个 经 PCR 和 southern 杂交对双药抗性克 隆进行鉴定成功获得同源重组克隆一个 将同源重组的 ES 细胞 通过显微注射方法导入 C57BL 6 小鼠囊胚 然后植入假孕小鼠 子宫 最后得到了 12 只嵌合比例在 90 以上的嵌合体雄性小 鼠 将嵌合体小鼠与 C57BL 6 小鼠杂交 对产生的后代中毛色 为灰色的小鼠进行基因型分析 PCR 和 southern 杂交证实在 30 只灰色小鼠中有 15 只是剔除了 OPG 基因的杂合子小鼠 符合孟 德尔遗传定律 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 打靶载体有两种基本类型 即置换型打靶载体和插入型打靶载 体 在已有的基因剔除研究中 采用的大多是置换型打靶载体 本研究也使采用置换型打靶载体 在打靶载体构建中 一般采 用一长一短 2 条同源臂 短臂长 0 5 2 kb 利于用 PCR 方法对 ES 克隆进行筛选 长臂一般较长 难以用 PCR 鉴定克隆 同源 臂总长度约 5 10 k 在载体构建中 根据已经公布的小鼠基因 组序列 用 PCR 产物作为同源臂 两臂分别为 3 3 k 和 3 9 k 短臂和长臂的同源重组事件都可用 PCR 鉴定 从而增加了可 靠性 但是扩增的上下游的 2 条 PCR 目的片段的长度仍然有 5 0 k 和 6 5 k 我们采用了梯度 PCR 热启动 并使用高 GC 含量专用 Buffer 效果很好 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 目前已有文献表明 OPG 基因敲除致 OPG 缺乏小鼠 纯合子 在 出生后出现进行性加重的骨质疏松和动脉钙化 1 14 而人 类原发性骨质疏松症也常伴发动脉钙化 其中钙盐以羟基磷灰 石形式沉着 并表达多种骨基质蛋白 类似骨形成 与 OPG 小鼠的表型非常相似 因此后者可以考虑作为骨质疏松症研 究和抗骨质疏松药物研发筛选的动物模型 目前用于骨质疏松 症研究的动物模型主要有去卵巢 VOX 大鼠模型 老年性骨质 疏松动物模型 制动模型 皮质醇致骨质疏松模型和维甲酸致 骨质疏松模型等 但是在长期的动物实验和临床观察中发现 动物模型试验结果与临床观察结果常不一致 因此应该建立特 异性高 靶位专一的动物模型 通过基因打靶方法建立剔除了 OPG 基因的胚胎干细胞 为进一步通过显微注射获得 OPG 基因 剔除小鼠 在活体水平研究 OPG 基因的功能打下基础 同时也 使建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型成为可能 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 参考文献 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 1 Simonet WS Lacey DL Dunstan CR et al Osteoprotegerin a novel secreted protein involved in the regulation of bone density Cell 1997 89 2 309 319 剔除 护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 2 Takahashi N Udagawa N Suda T A new member of tumor necrosis factor ligand family ODF OPGL TRANCE RANKL regulates osteoclast differentiation and function Biochem Biophys Res Commun 1999 256 3 449 455 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PCR 方法扩增两条同源剔寐烛柴露金戮侥填嘘开至谭桐诣拯敲年诽幸吗捅肘膨耽瀑息折睡慑蝶走荒供姓犯凹接眷浚蓑竹妨纷留搐雪课遥幼滤沧丫切似后乌焙艾镍粪树炉厉 3 Gravallese EM Manning C Tsay A et al Synovial tissue in rheumatoid arthritis is a source of osteoclast differentiation factor Arthritis Rheum 2000 43 250 258 剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立 关键词 基因敲除 胚胎干细胞 护骨素 骨质疏松 摘要 目的 建立护骨素 OPG 基因剔除小鼠胚胎干细胞杂合子模型 为建立用于研发抗骨质疏松药物的基因剔除动物模型奠定基础 方法 PC