地区科学基金项目标书范例

国家自然科学基金申请书 2008 版 第 1 页 版本 1 006 348 申请代码 C1401 受理部门 收件日期 受理编号 解除保护 国家自然科学基金国家自然科学基金 申申 请请 书书 2 2 0 0 0 0 8 8版版 资助类别 地区科学基金项目 亚类说明 附注说明 项目名称 急性低血压影响前庭功能的谷氨酸受体机制研究 申 请 者 电话 依托单位 通讯地址 邮政编码 单位电话 电子邮件 申报日期 2008 年 3 月 10 日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 2 页 版本 1 006 348 基本信息基本信息 zYleU7IM 姓名性别男 出生 年月 1958 年 2 月民族朝鲜族 学位博士职称教授主要研究领域神经生理学 电话电子邮件 传真个人网页 工作单位延边大学 基础医学院 申申 请请 者者 信信 息息 在研项目批准号 名称代 码 联系人电子邮件 依托单位信息依托单位信息 电话网站地址 单 位 名 称代 码 合作单位信息合作单位信息 在此录入修改 项目名称 急性低血压影响前庭功能的谷氨酸受体机制研究 资助类别地区科学基金项目 亚类说明 附注说明 申请代码C1401 人体生理学 基地类别 预计研究年限2009 年 1 月 2011 年 12 月研究属性基础研究 项项 目目 基基 本本 信信 息息 申请经费25 0000 万元 摘摘 要要 限限 400400 字字 很多研究表明前庭影响血压 而申请人又发现血压反过来也能影响前庭 功能 急性低血压通过前庭器官改变前庭神经核 vestibular neuclar VN 功能 且可 能与谷氨酸的释放有关 但其受体机制尚不清 本课题提出低血压通过前庭神经释放谷氨 酸并与 VN 内相应受体参与继发性血压调节的假说 拟在清醒大鼠损伤一侧前庭器官不同 时期 用微量透析 高效液相分析等方法 观察 VN 内谷氨酸含量的变化 结合药理学和 免疫组化法 分析受体激动剂和阻断剂对 VN 细胞 pERK1 2 和 c Fos 表达变化 探讨低血 压影响 VN 功能活动的谷氨酸受体类型和细胞内信号变化关系 揭示前庭可能参与继发性 血压调节和血压变化所致眩晕的谷氨酸递质及其受体机制 目前国内外尚未见类似报道 将首次揭示正常和一侧前庭损伤不同时期 VN 内谷氨酸及其受体与急性低血压的相关性 为前庭参与血压调节的中枢机制研究提供理论依据 并为治疗相关疾病提供新的思路 关关 键键 词词 用分号分开 最多 5 个 血压 前庭损伤 前庭神经核 谷氨酸 受体 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 3 页 版本 1 006 348 经费申请表经费申请表 金额单位 万元 科目申请经费备注 计算依据与说明 一一 研究经费研究经费18 5000 1 科研业务费3 5000 1 测试 计算 分析费0 0000 2 能源 动力费0 0000 3 会议费 差旅费2 0000国际国内学术会各 1 次 4 出版物 文献 信息传播费1 0000文献复印 文献检索 论文刊登费等 5 其它0 5000 2 实验材料费15 0000 1 原材料 试剂 药品购置费12 0000 动物 1 5 免疫 2 0 各种试剂 3 5 流动相 1 5 分离柱 3 0 电极 0 5 2 其它3 0000透析膜和各种导管 1 5 其他消耗品 1 5 3 仪器设备费0 0000 1 购置0 0000 2 试制0 0000 4 实验室改装费0 0000 5 协作费0 0000 二二 国际合作与交流费国际合作与交流费2 0000 1 项目组成员出国合作交流1 0000选派 1 2 名项目组成员出国短期培训和交流 2 境外专家来华合作交流1 0000聘请 1 名国外专家来华进行学术交流 三三 劳务费劳务费3 3000研究生劳务费 15 四四 管理费管理费1 2000 5 合合 计计25 0000 国家其他计划资助经费0 0000 其他经费资助 含部门匹配 0 0000 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计其他经费来源合计0 0000 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 4 页 版本 1 006 348 报告正文报告正文 查看报告正文撰写提纲 一 立项依据与研究内容一 立项依据与研究内容 研究意义 研究意义 位于内耳的前庭器官中的半规管通过感知角加速运动 椭圆囊和球囊则通过感知 线加速运动和重力刺激 导致反射性姿势调节 即末梢前庭感受器感知头部的运动 把传入信号经前庭神经传达到前庭神经核 vestibular neucler VN 后 诱发前庭 眼球 反射 前庭 脊髓反射 前庭 自主神经反射 关于前庭 自主神经反射中 目前很多研究主要集中在对前庭器官的过度刺激或单 侧前庭器官损伤所致恶心 呕吐 眩晕 心率加快 出汗等自主神经症状上 有文献 报道 参与血压调节的前庭 自主神经反射是末梢前庭感受器的传入信号到达 VN 后 通过多种中枢神经通路从延髓吻侧腹外侧区神经元传达到交感神经 构成作用于心脏 和血管的神经传导径路 众所周知 前庭器官通过感知头部运动后参与血压的调节 但是 血压的变化对前庭器官功能的影响方面研究甚少 原发性低血压 心衰 心梗 心率不齐患者常伴有眩晕症状 但其发生机制并不确切 目前认为可能也与末梢前庭 感受器的血流变化有关 血压的降低常常引起眩晕 提示末梢前庭感受器可能对血压 的变化起反应 并可能参与继发性血压调节 本实验室利用电生理学和免疫组织化学方法 在麻醉动物发现急性低血压不仅改 变前庭神经和 VN 细胞的自发放电活动 而且也能增加 VN 神经细胞内细胞 8 兴奋标 志物 pERK1 2 蛋白和 c Fos 基因的表达 增加谷氨酸的含量 这些变化可被破坏前庭 器官所反转 考虑急性低血压时前庭器官的功能改变与前庭神经释放谷氨酸有关 设 想若能在清醒动物观察诱发急性低血压时结合药理学方法 观察 VN 区的谷氨酸 pERK1 2 和 c Fos 的变化 将有助于阐明前庭器官参与血压变化引起的继发性血压调 节和血压变化所致眩晕的谷氨酸及其受体机制 谷氨酸的受体有促离子型受体和促代谢型受体 他们被激活后通过细胞内各级酶 的级链磷酸化反应或通过调控基因表达改变细胞的功能活动 但是尚无在血压变化时 谷氨酸通过什么受体影响 VN 细胞功能的相关研究报道 本研究为了阐明血压的变化通过前庭系统继发性地参与血压调节和急性低血压 心衰 心梗 直立性低血压患者常伴有的眩晕症的谷氨酸受体机制 在清醒自由活动 大鼠 利用核团微量透析 高效液项分析 药理学 免疫组化和行为学等方法 观察 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 5 页 版本 1 006 348 正常和破坏一侧外周前庭器官不同时期 诱发急性低血压时 VN 内谷氨酸含量 pERK1 2 和 c Fos 基因的变化和动物行为的改变 国内外研究现状 国内外研究现状 1974 年 Doba 等首次报道前庭器官参与直立性低血压的调节后 开始了对前庭 自 主反射的研究 发现刺激前庭器官可使呼吸变得急促 心律加快 血流重新分布 1 2 并参与动脉血压的调节 3 那么 血压是否也会影响前庭系统的功能活动 有学者指出 4 基底动脉短暂缺 血性眩晕患者脑干听力诱发电位也受到抑制 而且老年性眩晕症的 90 以上是由于脑 血管缺血所致 5 但是尚无内脏功能尤其是血压变化也影响前庭功能的直接报道 根据用硝酸甘油 sodium nitroprusside SNP 引起低血压和脑血流量改变的相关 研究发现 SNP 使血压降低 50 以上时脑血流量明显减少 而血压降低不足 50 时脑 血流量不出现明显变化 但是耳蜗的血流量随着血压的降低成比例减少 认为血压降 低 10 30 时脑血流量并不降低 只改变了前庭器官的血流量 推测这是血压降低 可能通过激活 VN 使体循环血压反射性升高的一种代偿性反应 6 提示前庭器官可能 继发性地参与血压的调节 我们的研究 7 11 也发现 SNP 诱发急性低血压改变前庭传入神经和 VN 神经元的 自发放电活动 并增加 VN 内 c Fos 基因表达 这种作用被破坏外周前庭器官所反转 由图 1 可见急性低血压增强 VN 内 型神经元的活动 却使 型神经元的活动则有降 低倾向 而在破坏单侧前庭感受器后这种现象发生反转 VN 内 c Fos 表达实验又发现 图 2 正常动物诱发急性低血压引起两侧 VN 内 c Fos 基因表达明显增加 破坏单 侧前庭器官的动物损伤侧 VN 内 c Fos 表达并不增加 Kim 12 等又报道 失血性急性低 血压增加 VN 内 pERK1 2 表达 破坏前庭器官时 pERK1 2 表达则明显减少 提示 血 压的降低可以通过前庭器官和 VN 引起前庭反应 其中有前庭感受器的参与 而且前 庭器官的刺激不仅影响血压 反过来血压的变化也能影响前庭器官的活动 这种活动 可能意味着急性低血压通过前庭器官参与继发性的血压调节 VN 区的神经递质种类繁多 其中至少有谷氨酸可能作为前庭传入神经的初级神 经递质或调质发挥作用 13 有文献报道 前庭代偿与其末梢释放谷氨酸及其离子型和 代谢型受体 14 也与 GABA 递质 15 有关 而在前庭 眼球反射时前庭器官的传入神经 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 6 页 版本 1 006 348 到达 VN 后其末梢释放的递质中有氨基酸类递质 谷氨酸 天冬氨酸 GABA 16 本室的最近研究发现 17 用药物或放血等方法在麻醉大鼠诱发急性低血压时 正 常动物 VN 内谷氨酸的含量明显增加而牛黄酸含量明显减少 但是损伤单侧前庭器官 动物慢性期损伤侧 VN 内谷氨酸和牛黄酸含量没有明显变化 表明急性低血压兴奋末 梢前庭感受器 使其传入信号传达到 VN 后分泌谷氨酸来改变 VN 神经元的活动 申请人的预实验已经发现 18 在清醒无麻醉正常大鼠诱发急性低血压时 VN 谷 氨酸含量明显增加而牛磺酸含量却明显降低 这种现象在一侧迷路损伤慢性期 损伤 侧 VN 区谷氨酸含量则无明显变化 但是牛磺酸含量仍然明显下降 而在健康侧 VN 内谷氨酸和牛磺酸含量都明显增加 图 3 和 4 但是到目前为止 尚未见到关于急性低血压通过兴奋外周前庭器官 其末梢释放 谷氨酸等氨基酸类递质以后 通过何种受体改变 VN 的功能活动的研究报道 主要参考文献 主要参考文献 1 Wilson TD Cotter LA Draper JA et al Vestibular inputs elicit patterned changes in limb blood flow in conscious cats J Physiol 2006 Sep 1 575 Pt 2 671 84 2 T D Wilson L A Cotter J A Draper et al Effects of postural changes and removal of vestibular inputs on blood flow to the head of conscious felines J Appl Physiol 2006 100 1475 1482 3 Gotoh TM Fujiki N Matsuda T et al Roles of baroreflex and vestibulosympathetic reflex in controlling arterial blood pressure during gravitational stress in conscious rats Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2004 286 R25 R30 4 唐开雄 陈瑞陶 蔡瑞等 椎基底动脉短暂缺血性眩晕患者脑血流量与脑干听力诱 发电关系研究 华西医大学报 2000 31 1 80 81 5 殷国华 老年人眩晕的病因分析 山东医大基础医学院学报 2001 l5 6 328 330 6 Hamaguchi M Ishibashi T Katsumata N et al Effect of sodium nitroprusside MR7S1 and nitroglycerin on the systemic renal cerebral and coronary circulation of dogs anesthetized with enflurance Cardiovasc Drugs Ther 1992 6 611 622 7 Byung Rim Park Min Sun Kim Ggue hyn Yee et al Changes in vestibular nerve activity following acute hypotension in rats Korean J physiol pharmacol 2003 7 85 89 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 7 页 版本 1 006 348 8 Min Sun Kim Jae Hyo Kim Davy kry et al Effects of acute hypotension on expression of cFos like protein in the vestibular nuclei of rats Brain Research 2003 962 111 121 9 Min Sun Kim Jae Hyo Kim Yuan Zhe Jin Davy kry Byung Rim Park Temporal changes of cFos like protein expression in medial vestibular nuclei following arsanilate induced unilateral labyrinthectomy in rats Neuroscience Letters 2002 319 9 12 10 Yuan Zhe Jin Guang Shi Jin Min Sun Kim Byung Rim Park Role of central vestibular pathway on control of blood pressure during acute hypotension in rats J Korean Balance Soc 2005 4 2 189 200 11 Park BR Kim MS Kim JH Jin YZ Effect of acute hypotension on neuronal activity of vestibular nuclei in rats Neurorport 2001 12 3821 3824 12 Min Sun Kim Myoun Ae Choi Dong Ok Choi et al Asymmetric activation of extracellular singal regulated kinase 1 2 in rat vestibular nuclei by unilateral labyrinthectomy Brain research 2004 1011 238 242 13 Sasa M Takeshita S Amano T et al Primary neurotransmitters and regulatory substances onto vestibular nucleus neurons Biol Sci Space 2001 15 4 371 4 14 Gliddon CM Sansom AJ Smith PF et al Effects of intra vestibular nucleus injection of the group I metabotropic glutamate receptor antagonist AIDA on vestibular compensation in guinea pigs Exp Brain Res 2000 134 1 74 80 15 Giardino L Zanni M Fernandez M et al Plasticity of GABA a system during ageing focus on vestibular compensation and possible pharmacological intervention Brain Res 2002 Mar 1 929 1 76 86 16 Andrianov GN Puyal J Raymond J et al Immunocytochemical and pharmacological characterization of metabotropic glutamate receptors of the vestibular end organs in the frog Hear Res 2005 204 200 209 17 于海玲 安英 邴艳华 金清华 崔勋 金元哲金元哲 急性低血压对前庭神经内侧核 区谷氨酸和牛磺酸含量的影响 生理学报 2006 58 2 177 182 18 安英 于海玲 邴艳华 金清华 崔勋 金元哲金元哲 急性低血压对清醒大鼠前庭神 经内侧核区谷氨酸和牛磺酸含量的影响 中国临床康复 2006 10 30 82 85 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 8 页 版本 1 006 348 2 项目的研究内容 研究目标 以及拟解决的关键问题 项目的研究内容 研究目标 以及拟解决的关键问题 研究内容 研究内容 本研究拟用清醒大鼠 药物或外科手术制备外周前庭器官损伤模型后 用核团内 微量透析 高效液相色谱 免疫组织化学 药理学 行为学等方法 探讨急性低血压 兴奋 VN 时 VN 内谷氨酸等氨基酸类神经递质含量的变化及谷氨酸受体机制 将有助 于阐明血压影响前庭功能 并继发性地参与血压调节的谷氨酸及其受体机制 并为临 床治疗相关疾病提供新的思路 实验动物选用 250 300g 的清洁级 Wistar 系雄性大鼠 在清醒状态下进行实验 诱发急性低血压用静脉注射 SNP 15 g kg min 3min 使动脉血压下降 30 左 右 为了研究前庭代偿的不同时期 急性低血压对 VN 区神经递质含量变化的相关性 实验分前庭感受器损伤后急性期急性期 24 48 小时 和慢性期慢性期 两周后 两个部分进行 外周前 庭器官的永久破坏用对氨基苯基砷酸盐行化学性损毁法或外科手术损毁法 1 正常清醒动物 正常清醒动物 VN 区谷氨酸含量 区谷氨酸含量 pERK1 2 和和 c Fos 的表达 的表达 利用神经核团微量透析法和免疫组织化学法 观察 VN 内谷氨酸等氨基酸类神经递 质含量 pERK1 2 和 c Fos 的表达 明确正常清醒动物 VN 内氨基酸类递质的含量和细 胞兴奋标志物的表达情况 2 急性低血压对正常清醒动物 急性低血压对正常清醒动物 VN 区谷氨酸含量 区谷氨酸含量 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影表达的影 响 响 观察正常清醒动物诱发急性低血压时 VN 内神经递质含量变化 pERK1 2 和 c Fos 的表达 证实本实验条件下 急性低血压是否兴奋 VN 同时证明谷氨酸参与其中 3 前庭损伤不同时期急性低血压对清醒动物 前庭损伤不同时期急性低血压对清醒动物 VN 区神经递质含量 区神经递质含量 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影响 表达的影响 一侧前庭损伤急性期 损伤 24 48 小时 和慢性期 损伤 2 周 观察诱发急性 低血压前后双侧 VN 区神经递质 pERK1 2 和 c Fos 的表达差异 阐明前庭损伤不同时 期 A VN 内上述指标的变化 B 急性低血压与上述指标的关系 4 受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物 受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物 VN 区区 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影响 表达的影响 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 9 页 版本 1 006 348 一侧前庭器官损伤后的不同时期用药理学和免疫组织化学法 脑室注入受体兴奋剂 和阻断剂 如谷氨酸和谷氨酸的拮抗剂 Dizocilpine MK 801 等 后比较观察正常和损 伤前庭动物双侧 VN 内 pERK1 2 和 c Fos 表达变化 进一步阐明前庭损伤不同时期受 体兴奋剂和阻断剂对 VN 不对称兴奋的影响 同时通过动物行为变化 观察兴奋剂和 阻断剂对前庭失代偿行为的影响 5 受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物诱发急性低血压后受体兴奋剂和阻断剂对前庭损伤不同时期清醒动物诱发急性低血压后 VN 区区 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影响 表达的影响 一侧前庭器官损伤后的不同时期 诱发急性低血压前后观察损伤侧和健侧 VN 内 pERK1 2 和 c Fos 的表达 比较分析两侧的差异 确定前庭损伤不同时期 急性低血 压影响 VN 功能受体功能变化 最终验证急性低血压兴奋外周前庭器官 通过前庭神经至少释放谷氨酸并通过相应 受体改变 VN 功能的假说 同时阐明前庭损伤不同时期这些递质和受体功能变化的相 关性 研究目标 研究目标 1 阐明一侧前庭损伤不同时期 两侧 VN 区谷氨酸含量变化的相关性 2 在正常清醒动物 通过诱发急性低血压 观察 VN 内神经递质含量变化 证明 急性低血压与 VN 内谷氨酸含量变化的相关性 通过 pERK1 2 和 c Fos 表达变化证明 急性低血压兴奋 VN 3 一侧前庭器官损伤的清醒动物 通过诱发急性低血压 观察前庭器官损伤不同 时期动物双侧 VN 内神经递质含量的变化 证明前庭损伤不同时期急性低血压与 VN 内谷氨酸含量变化的相关性 同样通过 pERK1 2 和 c Fos 表达变化 阐明前庭损伤不 同时期急性低血压前后 VN 功能活动变化 4 使用受体兴奋剂或阻断剂后 观察一侧前庭器官损伤的清醒动物 VN 内 pERK1 2 和 c Fos 表达的影响 阐明一侧前庭损伤后 前庭代偿不同时期 VN 的兴奋与 相应受体的关系 通过动物行为变化 观察兴奋剂和阻断剂对前庭失代偿行为的影响 5 使用受体兴奋剂或阻断剂后 观察急性低血压对一侧前庭器官破坏动物 VN 内 pERK1 2 和 c Fos 表达的影响 确定前庭损伤不同阶段参与急性低血压兴奋 VN 的谷氨 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 10 页 版本 1 006 348 酸受体功能变化 拟解决的关键科学问题 拟解决的关键科学问题 1 明确清醒动物 VN 区谷氨酸等氨基酸类递质的含量 2 阐明清醒动物急性低血压兴奋 VN 的谷氨酸的受体机制 3 阐明清醒动物前庭损伤不同时期 急性低血压与 VN 的谷氨酸含量及其受体功 能的关系 4 揭示清醒动物一侧外周前庭器官损伤不同时期 前庭代偿与谷氨酸含量及其受 体的相互关系 3 拟采取的研究方案及可行性分析 拟采取的研究方案及可行性分析 拟采取的研究方法和实验手段 拟采取的研究方法和实验手段 1 动物 动物 本实验选用 250 300g 的清洁级 Wistar 系雄性大鼠 为了消除麻醉对 动物心理和行为的影响 实验观察全部在清醒状态下进行 2 破坏前庭器官 破坏前庭器官 外周前庭器官的永久破坏行化学和手术损毁法 化学损毁法 水合氯醛 300mg kg 腹腔注射麻醉 从外耳穿透鼓膜向中耳注入对氨基苯胂酸盐 sigma 公司产品 用 0 3M 碳酸钠溶液配成 100mg ml 后放入脱脂棉 并置动物仰卧 位 使药物持续缓慢吸收 可使动物在 6 个小时后开始出现前庭损伤症状 手术损毁 法 水合氯醛麻醉 在耳廓后去毛 常规消毒 暴露颞骨下缘 钻开骨缘 露出水平 半规管 抽吸外淋巴液 并用聚乙烯管向前庭壶腹处灌注无水酒精后留管 缝合皮肤 肌肉注射抗生素 3 血压记录和诱发急性低血压 血压记录和诱发急性低血压 水合氯醛麻醉下 行股动 静脉插管 动静脉 导管从后背皮下穿到头部 动脉导管连接 BL 420E 型生物机能实验系统 监测血压 静脉注射 SNP 15 g kg min 3min 诱发低血压 使血压约下降 30 4 植入微量透析探针外套管 植入微量透析探针外套管 水合氯醛麻醉 参照大鼠脑图谱 在 VN 内侧核 投射区将透析膜的外套管插入到 VN 区 后囟向后 2 4 2 9mm 正中线旁开 0 9 1 2mm 深度 6 5 7 0mm 后牙托粉固定 最后用直径 1cm 的套管套住动静脉管和 透析膜的外套管 周围用牙托粉固定 动物手术均在常规消毒下进行 待 24 小时后进 行透析液的收集 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 11 页 版本 1 006 348 5 脑部微量透析法 脑部微量透析法 动物乙醚麻醉 透析膜外套管内插入透析探针 作用透析 膜为醋酸纤维膜 有效长度 1 5mm 外径 200 m 接触部位用腊封口 微量透析探针 图 5 通过透析用外套管插入到 VN 内固定 把改良林格液用微量灌流泵向大鼠 VN 区经透析管以 1 5 l min 速度灌流 同时经样本收集器收集样本 每管收集 10min 收 集量为 15 l 80 冷冻 以备神经递质含量分析 实验结束后取脑固定 60 m 连续 冰冻切片 中性红染色 光镜下进行组织学鉴定 6 清醒动物慢性记录法 清醒动物慢性记录法 将动物置于特制的电脑控制圆形代谢笼 直径为 28cm 高度 28cm 内饲养 在代谢笼内大鼠可自由活动 该方法能够使为了进行各种 记录所设置的导管因动物的活动所致的扭转信息经传感器传送给电脑 通过电脑使代 谢笼向反方向旋转使导管恢复正常 保证实验过程中记录用各种导管畅通 图 6 7 VN 区透析液的神经递质分析 区透析液的神经递质分析 生物活性物质微量分析系统 Microdialysis Total System DTA 300 和 HTEC 500 Eicom Japan 利用内置的高效液相色谱分析仪 连续 自动地 经过分离柱和电化学电极一次性测量样品中待测的包括谷氨酸的氨基 酸类神经递质 8 受体阻断剂或兴奋剂的使用 受体阻断剂或兴奋剂的使用 为了探讨急性低血压通过前庭神经释放谷氨酸 兴奋 VN 的受体机制 脑室或核团微量给与相应受体兴奋剂和阻断剂 如谷氨酸和拮 抗剂 Dizocilpine MK 801 9 免疫组织化学法 免疫组织化学法 利用免疫组化法研究 VN 内 pERK1 2 和 c Fos 的表达 正 常和诱发急性低血压后 5 10min 以内 动物深麻醉 利用 4 左右的 0 1 PBS 缓冲液 灌流心脏 0 1 PBS 缓冲液稀释的 4 多聚甲醛溶液灌流 剥离脑组织 4 多聚甲醛 溶液室温固定 30 的蔗糖溶液脱水 40 m 冰冻切片 按着相关要求进行免疫学反应 略 染色 利用图象分析仪分析 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 12 页 版本 1 006 348 技术路线 技术路线 前庭正常 一侧前庭损伤 急性期 24 48h 慢性期 2W 急性期 慢性期 双侧VN区递质含量 pERK c Fos表达 基础状态下VN区谷氨酸 pERK c Fos表达 低血压对VN区谷氨酸 pERK c Fos表达影响 低血压对双侧VN区递质 pERK c Fos影响 受体激动 阻断剂对双侧VN区低血压效应影响 pERK c Fos 双侧VN区递质含量 pERK c Fos表达 低血压对双侧VN区递质 pERK c Fos影响 受体激动 阻断剂对双侧VN区低血压效应影响 pERK c Fos 技技术术路路线线方框方框图图 1 动物的选择 动物的选择 利用升降姿势反射和旋转实验选择前庭功能正常 体重在 250 300g 的清洁级 Wistar 系雄性大鼠 2 动物状态 动物状态 以清醒状态自由活动大鼠为研究对象 在电脑控制代谢笼中饲养并 进行各项实验 3 破坏前庭器官 破坏前庭器官 详见研究方法和实验手段 实验观察分前庭器官破坏急性 期和慢性期进行 4 诱发急性低血压 诱发急性低血压 静脉注射 SNP 使血压约下降 30 5 前庭损伤急性期实验 一侧前庭损伤 前庭损伤急性期实验 一侧前庭损伤 4 48 小时后 小时后 1 单纯低血压对清醒动物 单纯低血压对清醒动物 VN 区各种神经递质含量的影响 区各种神经递质含量的影响 选择动物选择动物 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 13 页 版本 1 006 348 动物腹腔注射水合氯醛麻醉 留置微量透析探针外套管 动静脉插管 待动 物苏醒后代谢笼内饲养 并稳定 24h 以上 乙醚麻醉 微量透析探针外套管内插入透析探针 并与动静脉插管一起连上 实验记录系统 每隔 10min 钟收集前庭正常动物 VN 区灌流液 3 次 测定和分析灌流液中神 经递质含量 以这 3 个含量的平均值作为对照值 比较分析诱发急性低血压后 VN 区 各种神经递质含量的变化百分比 下同 静脉注射 SNP 诱发急性低血压后 每隔 10min 钟收集灌流液 6 次 测量灌流 液中神经递质含量 比较分析与诱发低血压前对照值的差异和随时间的变化 2 单纯低血压对清醒动物 单纯低血压对清醒动物 VN 区区 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影响 表达的影响 动物腹腔注射水合氯醛麻醉 动静脉插管 待动物苏醒后代谢笼内饲养 并 稳定 24h 以上 乙醚麻醉 动静脉插管连上实验记录系统 分别于 SNP 诱发急性低血压后 3 5 7 9min 时 进行动脉灌流固定脑组 织 冰冻切片 免疫组化反应 比较分析与对照组 VN 区 pERK1 2 和 c Fos 表达的差 异 3 低血压对损伤一侧外周前庭器官动物 低血压对损伤一侧外周前庭器官动物 VN 区各种神经递质的影响 区各种神经递质的影响 同 5 1 的 水合氯醛麻醉 手术破坏外周前庭器官 在诱发急性低血压实验前 24h 时 乙醚麻醉 留置微量透析探针外套管内插 入透析探针 并与动静脉插管一起连上实验记录系统 代谢笼饲养 分别在破坏前庭器官 24h 和 48h 时 每隔 10min 钟收集诱发急性低血压前 NV 区灌流液 3 次 测定和分析灌流液中神经递质含量 静脉注射 SNP 诱发急性低血压后 每隔 10min 钟收集灌流液 6 次 分别测量 双侧 VN 区灌流液中神经递质含量 比较分析与急性低血压前后 双侧 VN 内的差异 和随时间的变化 4 低血压对损伤一侧外周前庭器官动物 低血压对损伤一侧外周前庭器官动物 VN 区区 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影响 表达的影响 同 5 2 的 破坏外周前庭器官 同 5 3 的 连续观察动物行为学指标的变化 3 周 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 14 页 版本 1 006 348 同 2 的 和 5 受体兴奋剂和阻断剂的效应 受体兴奋剂和阻断剂的效应 动物腹腔注射水合氯醛麻醉 动静脉插管 侧脑室留置注射用外套管 待动物 苏醒后代谢笼内饲养 并稳定 24h 以上 乙醚麻醉 注射用外套管内插入注射管 并与动静脉插管一起连上实验记录系 统 稳定 1h 后 脑室注射受体兴奋剂或阻断剂 观察动物行为学指标 同 5 2 的 和 6 前庭损伤慢性期实验 一侧前庭损伤 前庭损伤慢性期实验 一侧前庭损伤 2 周后 周后 1 低血压对一侧损伤前庭器官动物 低血压对一侧损伤前庭器官动物 VN 区各种神经递质影响 区各种神经递质影响 水合氯醛麻醉 手术或化学损伤前庭器官 2 周后进行实验 收集 VN 区灌流液前 1 天 再次水合氯醛麻醉 留置微量透析探针外套管 动静脉插管 待动物苏醒后代谢笼内饲养 并稳定 24h 以上 乙醚麻醉 插入透析探针 并与动静脉插管一起连上实验记录系统 每隔 10min 钟收集前庭正常动物 NV 区灌流液 3 次 测定和分析灌流液中神 经递质的成分和含量 诱发低血压后 每隔 10min 钟收集灌流液 6 次 测量灌流液中神经递质含量 比较分析与诱发低血压前对照值的差异和随时间的变化 2 低血压对一侧损伤前庭器官动物 低血压对一侧损伤前庭器官动物 VN 区区 pERK1 2 和和 c Fos 表达的影响 表达的影响 同 6 1 的 乙醚麻醉 动静脉插管连上实验记录系统 分别于诱发低血压后 3 5 7 9min 时 进行动脉灌流固定脑组织 冰冻切 片 免疫组化反应 比较分析与对照组 NV 区 pERK1 2s 和 c Fo 表达的差异 3 受体兴奋剂和阻断剂的效应 受体兴奋剂和阻断剂的效应 同 6 1 的 乙醚麻醉 注射用外套管内插入注射管 并与动静脉插管一起连上实验记录系 统 稳定 1h 后 脑室注射受体兴奋剂或阻断剂 观察动物行为学指标 同 6 2 的 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 15 页 版本 1 006 348 关键技术 关键技术 1 在清醒动物 诱发急性低血压和收集前庭神经核灌流液的过程中保证各记录系 统管道的畅通 2 精密制备规格一致的透析用探针 3 短时间内用免疫组化法测定 pERK1 2 和 c Fos 表达 4 VN 准确定位 可行性分析可行性分析 已有研究证明 血压的变化通过前庭神经传入到 VN 后 通过多种中枢神经通路 从延髓吻侧腹外侧区神经元传达到交感神经 构成作用于心脏和血管的神经传导径路 而且前庭器官通过感知头部运动后参与血压的调节 另外原发性低血压 充血性心衰 心梗 心率不齐患者常伴有眩晕症状 但其发生机制并不确切 认为可能与末梢前庭 感受器的血流变化有关 并可能参与继发性血压调节 我们在麻醉动物发现 急性低血压可通过改变前庭神经和 VN 细胞的自发放电 增加 VN 内 pERK1 2 和 c Fos 的表达 这些变化可被破坏前庭器官所反转 见于 VN 内有谷氨酸 并受前庭传入冲动的影响 推测急性低血压可能通过谷氨酸和相应受体 改变前庭系统的功能活动 我们的预实验已经检测到清醒动物诱发急性低血压时 VN 谷氨酸含量明显增加而牛磺酸含量却明显降低 这种现象在一侧迷路破坏后同侧 VN 区谷氨酸含量则无明显变化 但是牛磺酸含量仍然明显下降 而在健康侧 VN 内谷氨 酸和牛磺酸含量都明显增加 图 3 和 4 根据申请人的前期实验发现 急性低血压确实通过外周前庭器官激起传入神经兴 奋 VN 且其末梢释放的递制中有谷氨酸递质 结合我室在前庭代偿和诱发动物急性低 血压对 VN 区氨基酸类递质含量的研究基础 又已经培养了 1 名博士生和 3 名硕士生 发表了相关的研究论文多篇 现又承担一项教育部科技司博士点专项基金 前庭代偿 中前庭神经核内中枢化学机制研究 2007 12 2009 12 还具备比较完善的血压 记录系统多套 电脑控制代谢笼 冷冻切片机 脑内微量物质分析系统 2 套 图象分 析仪 用于实验的各种消耗品和试剂来源充足 有关技术完全过关 另外每年从韩国 的圆光大学校医科大学的生理学教研室能够得到价值人民币 1 2 万元的相关消耗品 鉴于有上述实验条件和研究基础可以保证本项研究的顺利进行 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 16 页 版本 1 006 348 4 本项目的特色与创新之处 本项目的特色与创新之处 1 科学意义 经过检索和查新 除了申请人的研究以外在国内外尚未发现类似的 研究 本研究提出 急性低血压兴奋前庭神经 通过其末梢至少释放谷氨酸并通过相 应受体改变 VN 的功能活动 进而参与继发性血压的调节假说 2 方法学 首次在清醒大鼠静脉注射 SNP 诱发急性低血压后 结合微量透析 高 效液相色普 免疫组织化学等方法 观察急性低血压时 VN 区谷氨酸含量 pERK1 2 和 c Fos 等细胞兴奋标志物质表达变化 同时结合药理学方法研究其受体机制 5 年度研究计划 预计研究结果 年度研究计划 预计研究结果 年度研究计划 年度研究计划 2009 年年 1 月月 2009 年年 12 月 月 1 测量前庭功能正常动物 VN 区神经递质 pERK1 2 和 c Fos 含量 2 诱发急性低血压后 观察 VN 区神经递质 pERK1 2 和 c Fos 含量变化 3 损伤一侧前庭器官急性期 损伤 24 和 48h 下略 观察健侧和损伤侧 VN 区神经递质 pERK1 2 和 c Fos 含量的变化 同时观察动物行为学指标的变化 4 损伤一侧前庭器官急性期诱发急性低血压后 观察健侧和损伤侧 VN 区神经 递质 pERK1 2 和 c Fos 含量的变化 5 分析资料 撰写论文 2010 年年 1 月月 2010 年年 12 月 月 1 损伤一侧前庭器官急性期 脑室注射相应受体激动剂和阻断剂后 观察动物 行为学指标的变化 2 损伤一侧前庭器官急性期 脑室注射相应受体激动剂和阻断剂后诱发急性低 血压 观察健侧和损伤侧 VN 内 pERK1 2 c Fos 含量的变化 3 损伤一侧前庭器官慢性期 损伤 2 周 下略 观察健侧和损伤侧 VN 区部 分神经递质和 pERK1 2 c Fos 含量的变化 同时观察动物行为学指标的变化 4 损伤一侧前庭器官慢性期诱发急性低血压后 观察健侧和损伤侧 VN 区神经 递质 pERK1 2 和 c Fos 含量的变化 5 分析资料 撰写论文 2011 年年 1 月月 2011 年年 12 月 月 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 17 页 版本 1 006 348 1 损伤一侧前庭器官慢性期 脑室注射相应受体激动剂和阻断剂后 观察动物 行为学指标的变化 2 损伤一侧前庭器官慢性期 脑室注射相应受体激动剂和阻断剂后诱发急性低 血压 观察健侧和损伤侧 VN 内 pERK1 2 c Fos 含量的变化 3 补充实验 4 资料分析 撰写论文 预期研究结果 预期研究结果 1 确定清醒动物 VN 区谷氨酸等氨基酸类神经递质的含量 2 阐明清醒动物急性低血压兴奋 VN 的谷氨酸和受体机制 3 揭示清醒动物一侧外周前庭器官损伤后不同时期前庭代偿与谷氨酸含量 谷氨 酸受体的关系 4 进一步提出急性低血压和前庭代偿与 VN 其他神经递质方面的新课题 5 公开发表 2 3 篇系列研究论文 6 培养 1 名博士生和 2 3 名硕士生 二 研究基础与工作条件二 研究基础与工作条件 1 工作基础 工作基础 申请人从 1982 年一直从事神经生理学研究 2000 2003 年留学韩国圆光大学校医 科大学生理学教研室时 在前庭生理学领域探讨了前庭器官与循环器官的关系及其机 制 最近在 Acta Physiologica Sinica 发表了 急性低血压对前庭神经内侧核 Gul 和 Tau 含量的影响 Role of central vestibular pathway on control of blood pressure during acute hypotension in rats 等前庭生理学方面论文 10 余篇 其中 3 篇收录于 SCI 发表了 蓝斑核在室旁核心血管活动调节中的作用 刺激大鼠蓝斑核时对胃 电和胃运动的影响 蓝斑核对大鼠迷走 迷走胃抑制反射的影响 等神经生理学方面 研究论文 20 余篇 蓝斑核对胃运动调节的研究 1991 年授予教育部科学进步二等 奖 2007 年 前庭代偿中前庭神经核内中枢化学机制研究 得到教育部博士点科研基 金资助 2004 年吉林省科技厅杰出青年课题 血压影响前庭功能的中枢化学机制 另外 申请人与韩国圆光大学校医科大学生理学教研室有着密切的业务联系 该教研 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 18 页 版本 1 006 348 室的主任教授 博士生导师 美国和韩国平衡学会常务理事朴柄林老师每年一合作的 形式资助人民币 2 万元左右的实验试剂 待实验结束后可以在国外刊物上发表高水平 的论文 另外申请人的预实验结果发现 在清醒无麻醉大鼠诱发急性低血压时 VN 谷氨酸 含量明显增加而牛磺酸含量却明显降低 这种现象在一侧迷路破坏后同侧 VN 区谷氨 酸含量则无明显变化 但是牛磺酸含量仍然明显下降 而在健康侧 VN 内谷氨酸和牛 磺酸含量都明显增加 图 3 和 4 本教研室的副教授 另有自然基金课题 自 1996 2001 年在日本宫崎医科大学第 一生理教研室留学 获得博士学位 她目前主要从事室旁核参与心血管中枢调节的神 经化学机制研究 利用清醒动物慢性记录法 脑部微量透析法 高效液相色谱法等实 验技术 系统地研究了参与应激反应时 NE NO 谷氨酸等神经递质的作用 其研究 成果主要发表在 Am J Physol Brain Reseach 等国际刊物上 共 9 篇 均收录于 SCI 2 工作条件 工作条件 实验室条件 实验室条件 本生理学教研室是吉林省教育厅和卫生厅的重点学科 吉林省中医药管理局中医药 科研基地三级实验室 吉林省卫生厅重点研究室 神经生物研究室 2000 年国务院 学位委员会批准为博士学位授予权点 已经 2 次得到教育部 211 工程建设 九五和 十五 的建设 2005 年 8 月又被成为教育部省部共建国家重点实验室 长白山天然资源 与功能因子实验室 的成员学科 目前本实验室具有澳大利亚埃德仪器公司生产的 综合生理分析系统 ML785 PowerLab 8sp 和 ML845 PowerLab4 25 系统各一台 日 本 Eicom 公司的 Eicom HTEC 500 生物活性物质微量分析系统 2 台 电脑控制代谢笼 冷冻切片机 图象分析系统和 400 余平方米的实验室 每年招收 8 10 名研究生和 4 5 名博士生 具有充足的人力资源和物力资源 3 申请人简历申请人简历 与本项目有关的论文 与本项目有关的论文 国家自然科学基金申请书 2008 版 第 19 页 版本 1 006 348 4 承担科研项目情况 承担科研项目情况 1 前庭代偿中前庭神经核内中枢化学机制研究 教育部科技司博士点专项基金资 助 课题编号 起止时间 2008 01 2010 12 经费来源 教育部科技发展中心 经费总额 6 万元 5 自然科学基金项目完成情况 自然科学基金项目完成情况 本研究室其他人员相关的自然基金研究完成情况 项目研究小组成员 项目名称 清醒大鼠室旁核参与血压调节的神经化学机制 编号 经费来源 国家自然基金项目 起止时间 2003 01 2003 12 该项目已经结题 除了因为各种试剂价格的提升导致的经费不足 没能完成阻断剂 确认氨基酸的具体作用机制外基本完成预期的目的 另外 因为该课题的研究期限为 一年性试探性资助 故的没有发表论文 项目摘要 项目摘要 下丘脑室旁核 PVN 不仅通过控制垂体激素的释放影响机体的内分泌功能 还 直接控制或调节某些自主神经传出纤维的活动 PVN 作为内分泌系统和自主神经系统 的统合部位 在机体心血管活动调节中起着重要作用 但其作用机制 特别是 PVN 内 神经化学机制还不是很清楚 因此 本研究在用电脑控制的代谢笼慢性记录清醒状态 自由活动大鼠的心血管活动变化的情况下 利用脑部微量透析法和高效液相色谱法观 察 PVN 局部细胞外液中的几种氨基酸 天冬氨酸 谷氨酸 古氨酰胺 甘氨酸 牛黄 酸 丙氨酸等 的浓度变化 探讨其