免疫学检测技术在食品安全中的应用

1 免疫学检测技术在食品安全中的应用免疫学检测技术在食品安全中的应用 杨明 甘肃农业大学 动物医学院 甘肃 兰州 食品安全问题在 21 世纪的今天已经成为全世界关注的重大问题 对国家的经济发展和消费 者的身体健康产生了重大影响 随着我国市场经济的的不断完善和发展 食品行业对外贸易与 日剧增 食品的质量与安全问题已成为影响农业和食品工业产品竞争力的关键因素 同时 由 于我国人民生活已由温饱型食物结构转向营业健康型食物结构 全民食品营业卫生知识得到普 及 人民的饮食消费观念也由数量型转向质量型 对食品卫生质量标准的要求越练越高 这就 对食品检测技术提出更高的要求 由于食品种类丰富 食品中检测的有毒有害物质种类和组分繁多 需要检测的物质质量极 低 样品中待检物的浓度常为 g ng 甚至 pg 级 除此之外 许多检测物除需检测物质本身 还涉及其衍生物和降解物测定 区别同位异构体以及元素的价态等 因此食品检测要求检测方 法更加准确 快速 方便 也使得其他学科的先进技术不断应用于食品检测领域中来 由于新 技术的引入 食品行业开发出了许多自动化程度和精确度很高的检测仪器 这不仅缩短了分析 时间 减少了人力误差 也大大提高了食品分析检测的速度 灵敏度和准确度 现代食品检测 技术主要包括以下几个方面 计算机视觉技术 现代仪器分析技术 食品物性的力学 声学和电学检测技术 电子传感检测技术 生物传感技术 核酸探针检测技术 PCR 基因扩增技术 免疫学检测技术 免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分 特别是三大免疫技术 荧光免 疫技术 酶免疫技术 放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用 利用免疫学检测技术可检 测细菌 病毒 真菌 各种毒素 寄生虫等 还可用于蛋白质 激素 其他生理活性物质 药 物残留 抗生素等的检测 其检测方法简便 快速 灵敏度高 特异性强 特别是单克隆抗体 的发展 使得免疫检测方法特异性更强 结果更准确 免疫分析是抗原与抗体的特异性 可逆性结合为基础的分析技术 1959 年 Yalow 和 Berson 将发射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了发射免疫测定法 从而开创了免疫分析这 一崭新领域 次后又发展了许多替代或非同位素免疫免疫分析法 1 免疫荧光技术在食品检测中的应用 免疫荧光技术在食品检测中的应用 免疫荧光分析 Immuno Fluorescence Assay IFA 始创于 20 世纪 40 年代初 1942 年 Cons 等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体 检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体 但此种荧光素标记物的性能较差 未能推广应用 20 世纪 50 年代 Riggs 等合成性能较为优良 的异硫氰酸荧光素 Mashall 等对荧光抗体的标记方法又进行了改进 从而使得免疫荧光技术逐 渐推广应用 1 1基本原理基本原理 抗体与荧光素结合后 并不影响其与相应的抗原发生特异性反应 事先将待测抗原固定与 玻璃载玻片上 滴加荧光标记抗体 若荧光标记抗体与相应的抗原发生特异性结合反应 不能 被缓冲液冲掉 载荧光显微镜下可观察到荧光 否则荧光抗体被缓冲液冲掉 在显微镜下观察 不到荧光 2 1 2荧光免疫测定法的分类荧光免疫测定法的分类 根据标记荧光产生的方式不同分为底物标记荧光测定法 荧光偏振免疫测定法 荧光猝灭 增强免疫测定法 FIA 可使用均相或非均相分析方式 均相 FIA 应用较多 1 2 1 底物标记荧光测定法底物标记荧光测定法 底物标记荧光测定法 SLFIA 使用一种酶的底物标记待测物 底物本身无荧光 在受到相 应酶的催化时能转变为荧光物 当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记底物间 的接触 样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或荧光强度增加 1 2 2 荧光偏振免疫测定法荧光偏振免疫测定法 使用偏振光作为激发光时 视分子的运动状态 发射的荧光可能是振动方向各向随机化的 普通荧光 或是只在某一平面振动的偏振荧光 ploarized fluorescence 在反应液中 游离的标 记物分子体积小 在布朗运动中转动速度快 受偏振光照射后产生的荧光偏振方向被分散 不 能产生偏振光 只发射普通荧光 与抗体结合的标记物分子体积增大 布朗运动速度减慢 甚 至不能转动而形成定向排列 所以受偏振光激发后能产生偏振荧光 样品中的待测物的量越大 偏振荧光的强度越高 1 2 3 荧光淬灭免疫测定法荧光淬灭免疫测定法 荧光淬灭免疫测定法 Fluoresecent Quenching Immunoassay 的原理是当荧光标记物与抗 体结合后发生荧光淬灭 荧光猝灭的机制尚不清楚 荧光淬灭可能与标记物与抗体结合后导致 电子振动状态的改变有关 1 2 4 荧光增强免疫测定法荧光增强免疫测定法 荧光增强免疫测定法 Fluoresecent Enhancement Immunoassay 的原理与荧光淬灭增强免 疫测定法相似 不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强 2 酶免疫检测技术在食品检测中的应用酶免疫检测技术在食品检测中的应用 酶免疫检测技术是在 20 世纪 60 年代在荧光和组织化学的基础上发展起来的一种新技术 最初用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织中抗原的鉴定和定位 随后发展为用于鉴定免疫扩 散及免疫电泳板上的沉淀线 到 1971 年 Engrall 等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体 建立了酶联 免疫吸附试验 ELISA 这一技术因其高度的准确性 特异性 应用范围广 检测速度快以及 费用低等优点 是目前食品检测中令人瞩目的有发展前途的一种新技术 2 1酶免疫技术的基本原理酶免疫技术的基本原理 用酶标记已知的抗原 抗体 然后与样品在一定条件下反应 如果样品中含有相应的抗 体 抗原 抗原抗体结合形成复合物中所带酶分子遇到底物时 能催化底物水解 氧化或还原 产生显色反应 这样就可以定性定量测定样品中的抗体 抗原 3 2 2酶免疫技术的分类酶免疫技术的分类 酶免疫技术发展迅猛 种类繁多 酶免疫技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术 酶 免疫测定技术又分为均相免疫测定和异相免疫测定技术 异相免疫测定技术又分为固相免疫测 定技术和液相免疫测定技术 2 3酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定技术 2 3 1 基本原理基本原理 抗体 抗原 与酶结合后 仍然能和相应的抗原 抗体 发生特异性结合 将待测样品事 先包被于固相载体表面 加入酶标抗体 抗原 酶将抗体 抗原 于吸附于固相载体上相应的 抗原 抗体 发生特异性结合反应 形成酶标记的免疫复合物 不能被缓冲液冲掉 当加入酶 的底物时 底物发生化学反应 呈颜色变化 颜色深浅与待测抗原或抗体的量有关 可定性或 定量测定抗原或抗体 ELISA 常用的方法有直接法 间接法 双抗体夹心法 双夹心法和竞争法 2 3 2 ELISA 技术在食品安全性检测中的应用及前景技术在食品安全性检测中的应用及前景 ELISA 技术把抗原抗体特异性与酶反应的敏感性相结合 使食品在未经分离的提取的情况下 即可进行定性和定量分析 近年来 该技术在食品安全检测中正逐步推广应用 用于细菌及其 毒素 真菌及其毒素 病毒 寄生虫的检测 还用于蛋白质 激素 农业残留 兽药残留和抗 生素及食品成分和劣质食品的检测分析 ELISA 技术由于灵敏度高 特异性强 检测费用低和易 于商品化 具有十分广阔的应用前景 3 放射免疫技术在食品检测中的应用 放射免疫技术在食品检测中的应用 放射免疫技术 Radio Immunoassay RIA 是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法 是由 Yalow 和 Berson 于 1960 年创建的标记免疫分析技术 由于标记物放射性核素的检测灵敏 性 本法灵敏度高 测定准确性良好 特别适应于蛋白质 激素和多肽的精确定量测定 3 1 基本原理基本原理 放射免疫分析的基本原理是标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争结合反应 在这一 反应系统中 作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的 抗体量一般采用能结合 40 50 的标 记抗原 而受检标本中的非标记抗原是变化的 根据标本中抗原的量不同 得到不同的反应结 果 当标记抗原 非标记抗原和特异性抗体三者同时在于一个反应系统时 由于标记抗原和非 标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力 因此两者相互竞争特异性的抗体 由于标记抗原与 特异性抗体的量是固定的 故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变 非 标记抗原量增加 相应的结合较多的抗体 从而抑制了标记抗原对抗体的结合 是标记抗原抗 体复合物的量相应减少 游离的标记抗原相应的增加 亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与 受检标本中抗原的浓度呈反比 若将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分开 分别测定其放射 强度 就可计算出结合的标记抗原 B 与游离的标记抗原 F 的比值 B F 这与标本中的 抗原呈函数关系 用一系列不同的标准抗原进行测定 计算相应的 B F 值 可得到一条剂量反 4 应曲线 受检标本在同样条件下进行测定 计算 B F 值 即可在剂量反应曲线是查出标本中的 抗原含量 放射免疫测定分为液相放射免疫测定和固相放射免疫测定 3 2 放射免疫技术在食品检测中的应用放射免疫技术在食品检测中的应用 RIA 测定就是应用放射性物质代替 ELISA 中的标记酶作为抗原或抗体耦联物 在食品安全检 测中最常见的同位素是 3H 和14C 1978 年 Charm 在 RIA 技术的基础上发展了放射免疫检测技 术 RRA 放射免疫检测在快速检测方面最成功的是 Charm 6600 7600 抗生素快速检测系统 该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生 素族在样品中的残留情况 目前 Charm 7600 检测系统就 内酰胺类 氯霉素类 四环素 类 磺胺类 氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被 FDA 认可 放射免疫技术由于可以避免假 阳性 适宜于阳性率较低的大量样品检测 对水产品 肉类产品 果疏产品中的农药残留量的 检测中广泛应用 还可检测经食品传播的细菌及毒素 真菌及毒素 病毒和寄生虫及小分子物 质和大分子物质 如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白 4 4 免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用 免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用 免疫胶体金检测技术又叫 Rosa Tests 法 是利用胶体金颗粒进行标记的一项新技术 4 4 1 1 基本原理基本原理 氯金酸 HAuCl4 在还原剂作用下 可聚合成一定大小的金颗粒 形成负电的疏水胶溶液 由于静电作用而成为稳定的胶体状态 故称胶体金 胶体金标记 实质上是蛋白质等分子被吸 附到胶体金颗粒表面的过程 吸附机理可能是胶体金颗粒表面带有负电荷 与蛋白质的正电荷 基团因静电吸附而行形成牢固结合 用已知还原法可以方便地从 HAuCl4制备各种不同的粒径 不同颜色的胶体金颗粒 这种球形的颗粒对蛋白质有很强的吸附功能 可以与葡萄球菌 A 蛋白 毒素 免疫球蛋白 糖蛋白 酶 抗生素 激素等非共价结合 免疫胶体金检测原理是利用了金颗粒具有电子密度的特性 当这些标记物在相应配体处大 量聚集时 肉眼可见红色或粉红色斑点 因而可用于定性或定量的快速检测方法中 这一方法 可通过银颗粒的沉积被放大 称之为免疫金银染色 4 4 2 2 免疫胶体金技术在食品检测中的应用免疫胶体金技术在食品检测中的应用 该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素 可在十分钟内快速检测牛奶中的抗生素 利用 该技术可检测的抗生素种类有六种 内酰胺 四环素 磺胺二甲嘧啶 恩诺沙星和黄曲霉 毒素 可检测的 内酰胺药物有氨苄青霉素 阿莫西林 邻氯青霉素头孢噻呋 头孢霉素和 青霉素 G 等 由于该技术结果直观 操作简单 在食品安全检测中有广阔的应用前景 5 5 单克隆抗体技术在食品检测中的应用单克隆抗体技术在食品检测中的应用 抗体主要由 B 淋巴细胞合成 每个 B 淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因 如果能选出一 个制造一种专一抗体的细胞进行培养 就可以得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群 即克 隆 单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体 1975 年 Kohler 和Milstein 发现将小鼠骨髓瘤细 5 胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合 形成了杂交细胞即可产生抗体 又可无限增殖 从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术 这一技术为医学和生物学基础研究开创了新纪元 是免疫 学领域的重大突破 5 5 1 1 基本原理基本原理 B 淋巴细胞具有专一性的合成针对某一抗原决定簇的抗体 但这种 B 淋巴细胞不能在体外 生长 而骨髓瘤细胞可在体外生长 应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合 二为一 得到杂种的骨髓瘤细胞即杂交瘤细胞 这种杂交瘤细胞即具有专一性合成某一抗体的 特性 也具有瘤细胞能在体外无限增殖的特性 用这种杂交瘤细胞培养的细胞群 可制备抗一 种抗原决定簇的特异性单克隆抗体 这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体称为第二抗体 主要 抗原能引起小鼠的抗体应答 应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体 5 5 2 2 单克隆抗体技术在食品检测中的应用单克隆抗体技术在食品检测中的应用 单克隆抗体在食品检测中最大的优点是特异性强 不易出现假阳性 在食品检测中有广泛 的应用前景 目前人们已制备出各种经食品传播和引起食物中毒的细菌及毒素 真菌及毒素 病毒 寄生虫 农药 激素等的单克隆抗体并建立的检测方法 磺胺二甲嘧啶和克伦特罗 瘦肉精 这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点 国内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体试剂盒和克伦特罗残留检测的 多克隆试剂盒 这两种试剂盒具有特异性强 仪器化程度低 样品前处理简单 检测时间短 在实际生产中应用前景广阔 填补了国内空白 单克隆抗体检测技术可在十分钟内快速检测有机磷类 氨基甲酸酯类 有机氯类 拟除虫 菊酯类及激素类的残留量为农产品的优质安全提供技术支持 英国建立了自动肉制品中的沙门氏菌的单克隆抗体检测方法 人们还制出了单核增生性李 特氏杆菌的单抗 用单抗 ELISA 检测该菌 乳中氯霉素的单克隆抗体检测技术也被建立 食品储藏过程中会受到霉菌污染 现已从青霉 毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成单克隆 抗体用 ELISA 方法可检出加热和未加热食品中的霉菌 6 6 免疫测定新技术免疫测定新技术 6 6 1 1 脂质体免疫测定法脂质体免疫测定法 脂质体免疫测定法 LIA 是一种较新的免疫测定技术 脂质体是由磷脂或由其他类脂分子 在水相中自发形成的一种密闭的双分子单层或多层囊泡 脂质体表面还可以连接抗原或抗体分 子 这种生物模拟膜在形成过程中能包裹水及其中的溶质 染料或酶 膜的稳定性可随免疫反 应有规律变化 根据释放出的标记物的量进行测定 所以 LIA 具有很高的信号放大作用 目前 LIA 主要存在脂质体的稳定性和非特异性溶解问题 6 6 2 2 克隆酶给予体免疫测定法克隆酶给予体免疫测定法 克隆酶给予体免疫测定法 CEDIA 是一种新型均相免疫测定法 CEDIA 中使用由重组 DNA 技术获得的 半乳糖苷酶两个独立的蛋白质片段 这两个片段独立存在时无酶活性 但两个 片段结合则显示催化活性 以此作为分析方法的基础 其中较小片段称为酶给予体片段 ED 6 另一片段称为酶受体片段 EA ED 标记物与抗体集合后不再与 EA 形成酶 所以当样品中待测 物增加时则游离 ED 标记物增多 使反应液中酶产生增加 经底物显色测定 CEDIA 是目前灵敏 度较高的均相免疫测定法 6 6 3 3 发光免疫测定法发光免疫测定法 发光免疫测定法 CLIA 常用鲁米诺 Luminol 异鲁米诺 Isoluminol 及其衍生物进 行标记 这些环肼类化合物在碱性条件下可被氧化产生 3 胺基苯二甲酸盐和 430nm 的发射光 在鲁米诺的芳氨基上进行烃链取代后产光性能增强 但若置换芳氨基则发光被破坏 另外丫叮 酯也用于发光标记 CLIA 操作简单 灵敏度高 测定速度快 但 CLIA 产光物质发光时间极短 数秒钟 测定误差较大 6 6 4 4 免疫传感器技术免疫传感器技术 免疫传感器是生物传感器的一种 近年来已取得迅速发展 免疫传感器的探头主要由两部 分组成 感受器 通常覆有连接有特异性抗体的可更换的传感膜 换能器 能将抗原抗体产生 的信号转换为可供仪器检测的电信号 免疫传感器使用对象广泛 专一性较强 高度的自动化 微型化与集成化减少对使用者及环境技术条件的依赖 测定速度快 适合现场或野外操作 6 6 5 5 多组分免疫测定法多组分免疫测定法 根据不