实验一：组培室的设计及仪器设备的使用.doc

专业班级：生物技术二班 学号：20120322208 姓名：莽斌实验日期：2014年3月10日 温度：19.8 大气压：82.07KPa同组人：王雪娇，杨佳梅，卢晓燕，蒋薇，袁蓉，林星龙，刘显号，关德宏，李玉圣 实验一：组培室的设计及仪器设备的使用一 实验目的1. 了解植物组织培养实验室和工厂化植物组织培养实验室的主要区别。2. 掌握植物组织培养实验室的布置与设计。3. 掌握植物组织培养实验室常见仪器设备的使用。4. 学会分析各类植物组织培养实验室的优缺点。二 实验原理1. 植物组织培养实验室是完成植物组织培养的重要场所，实验室的布置与设计的好坏影响着组培是否成功。2. 植物组织培养实验室由准备室，接种室，培养室和温室四大部分组成。（1） 准备室 功能：用于培养器皿的清洗，干燥，培养基的配置，分装和灭菌，试管苗的出瓶及整理工作。（2） 接种室（无菌操作室）功能：接种材料的灭菌，接种以及培养物的继代转接等。接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。（3） 培养室 功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁净并能保持一定的温度，光照及湿度，以促进植物材料的生长及分化。（4） 温室3. 在实际生产中应按照植物组织培养实验室布置与设计的要求来完成组培。4. 组培的设备和仪器是确保组培完成的条件，应正确使用相关仪器。三 仪器设备 植物组织培养实验室1. 常规设备（1） 天平 精确度达0.0001g的天平（分析天平）用于称量微量元素，植物生长调节剂和一些较高精确度的实验药品。精确度达0.01g和0.1g的天平用于称量大量元素，天平应放在平稳，干燥，不受震动的天平操作台上，应尽量避免移动。（2） 冰箱 一般家用普通冰箱即可。（3） 酸度计 用于测定培养基及其他溶液的pH值，一般要求可测定范围为1-14，精度为0.01。（4） 离心机 用于细胞，原生质体等活细胞分离，也用于培养细胞的细胞的细胞器，核酸及蛋白质的分离提取。（5） 加热器 用于培养基的配制。（6） 解剖镜 用于观察培养物的形态结构及茎尖剥离，可采用双筒实体解剖镜。2. 灭菌设备（1） 高压灭菌锅 用于耐热培养基，无菌水及各种器皿，用具的灭菌，有小型手提式，中型立式，大型卧式等不同规格。（2） 干热消毒柜 用于洗净后的器皿干燥，也可用于干热灭菌和测定干物重。（3） 过滤灭菌器 3. 无菌操作设备（1） 超净工作台 用于培养材料的消毒，分离切割，转接等，是常见的无菌操作设备，具有操作方便舒适，无菌效果好，工作效率高等优点。（2） 接种箱 接种箱是一个密闭较好的木质或玻璃箱，入口有袖罩，箱内安装紫外灯和日光灯。（3） 接种工具杀菌器 用于接种工具灭菌4. 培养设备（1） 光照培养架（2） 培养箱（3） 照度计 用于测量培养架灯光的光照强度。四 实验步骤1. 在教师的带领下参观植物组织培养实验室2. 在教师的讲解下完成组培常见设备仪器的使用方法3. 常用实验用具的洗涤高压灭菌锅的使用方法：（1） 在外层锅内加适量的水，将需要灭菌的物品放入内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。（2） 加热使锅内产生蒸气当压力表指针达到 33.78kPa时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，即将排气阀关好。（3） 继续加热，锅内蒸气增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力时，将火力减小，按所灭菌物品的特点，使蒸气压力维持所需压力一定时间，然后将灭菌器断电或断火，让其自然冷后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物灭菌锅使用注意事项a 待灭菌的物品放置不宜过紧；b 必须将冷空气充分排除，否则锅内温度达不到规定温度，影响灭菌效果；c 灭菌完毕后，不可放气减压，否则瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢甚至导致容器爆裂。须待灭菌器内压力降至与大气压相等后才可开盖；d 已有微电脑自动控制的高压蒸气灭菌锅，只需放去冷气后，仪器即可自动恒压定时，时间一到则自动切断电源并鸣笛，使用起来很方便。 酸度计的使用步骤：（1）检查酸度计的接线是否完好。接通电源，按下背面的电源开关，预热30min后方可使用。（2）取下复合电极上的电极套，注意不要将电极套中的饱和KCl溶液撒出或倒掉。用蒸馏水冲洗电极头部，用滤纸吸干残留水份。（3）定位在测量之前，首先对pH计进行校准，我们采用两点定位校准法，具体的步骤如下：a.打开电源开关，按“pH/mV”按钮，使仪器进入pH测量状态；b.用温度计测量被测溶液的温度，读数，例如25C。按“温度”旋钮至测量值25C，然后按“确认”键，回到pH测量状态。c.调节斜率旋钮至最大值。d.打开电极套管，用蒸馏水冲洗电极头部，用吸水纸仔细将电极头部吸干，将复合电极放入pH为6.86的标准缓冲溶液，使溶液淹没电极头部的玻璃球，轻轻摇匀，待读数稳定后，按“定位”键，使显示值为该溶液25C时标准pH值6.86，然后按“确认”键，回到pH测量状态。e.将电极取出，洗净、吸干，放入pH为4.01的标准缓冲溶液中，摇匀，待读数稳定后，按“斜率”键，使显示值为该溶液25C时标准pH值4.01，按“确认”键，回到pH测量状态。f.取出电极，洗净、吸干。重复校正，直到两标准溶液的测量值与标准pH值基本相符为止。注：在当日使用中只要仪器旋钮无变动则可不必重复标定。4、校正过程结束后，进入测量状态。用蒸馏水清洗电极，将复合电极放入盛有待测溶液的烧杯中，轻轻摇动，待读数稳定后，记录读数。完成测试后，移走溶液，用蒸馏水冲洗电极，吸干，套上套管，关闭电源，结束实验。五 注意事项使用高压灭菌锅的注意事项：1. 灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。2. 降温时待温度自然降至60以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂3. 在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120、两个大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。洗涤时的注意事项（1）加热或烧过的要冷却后再洗 （2）洗到水在壁面上能成股流下,擦净,晾干六作业 1.简述植物组织培养在生产上的应用。答:(1)脱毒繁殖。脱毒植物组培脱毒技术有茎尖培养脱毒、花药培养脱毒、愈伤组织脱毒、珠心胚培养脱毒、茎尖微体嫁接脱毒等。脱毒效果好后代遗传性稳定,是目前植物无病毒苗培育应用最广泛、最重要的一个途径。茎尖培养之所以能够除去病毒是因为病毒在植物体内的分布是不匀衡的。 （2）单倍体育种。通过组织培养手段增加遗传变异性来改良作物,已成为一条育种新途径。近年来利用植物组织培养获得单倍体植株的研究取得了很大进展。（3）胚培养。植物胚培养是采用人工的方法在无菌条件下从种子中将成熟胚和未成熟胚分离出来然后放在人工合成的培养基上培养,使它发育成正常的植株从而有效地克服远缘杂交不实的障碍获得杂种植株。（4）单细胞培养突变体的选择与应用。用单细胞培养的方法诱导单细胞突变筛选需要的突变体培养成植株经有性繁殖使遗传性状稳定下来。这是从细胞水平改造植物的一条途径。（5）体细胞杂交育种2.请绘制出植物组织培养实验室的设计示意图，并说明主要功能答： （一）基本实验室 基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万-20万，需3-4间实验用房，总面积60平方米。 1、准备室（化学实验室） 功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。 要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。 分类： 分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，但不适于大规模生产。 通间式-规模化实验室，准备室一般设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。准备试验的过程在同一空间进行，便于程序化操作与管理，试验中减少各环节间的衔接时间，从而提高工作效率。此外还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，从而减少规模化生产的人工劳动，更便 于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。 设备：准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。 2、洗涤灭菌室 功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。 要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。 设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。 3、无菌操作室（接种室） 功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。 要求：接种室宜小不宜大，一般78平米（10-20平米）即可，其规模根据实验需要和环境控制的难易程度而 定。要求封闭性好，干爽安静，清洁明亮，能较长时间保持无菌，因此不易设在容易受潮的地方；地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒；配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；为了保持清洁，无菌室应防止空气对流。接种室要求在适当位置吊装 12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。 一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸，并需定期灭菌处理，还可用紫外线照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。 设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。 4、培养室 功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。要求：约需 10-20平方米左 右，培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。 研究用实验室，通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室，也可以根据温度设置成高温和低温培养室，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。进行精细培养类型如细胞培养和原生质体培养，可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。 为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高 17m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长I3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。日光灯一般用40W，固 定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。 培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。 设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、转床、自动控时器、紫外灯、光照培养箱或人工气候箱、生化培养箱、边台实验台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。 5、缓冲间 功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外