乙型肝炎病毒在肝外组织中复制并影响血糖调节

乙型肝炎病毒在肝外组织中复制乙型肝炎病毒在肝外组织中复制 并影响血糖调节并影响血糖调节 摘要摘要 目的目的 研究肝外组织是否支持乙型肝炎病毒复制以及乙型肝炎的泛嗜性 对血糖调节的影响 方法方法 利用 PCR 法检测麻鸭血清中的鸭乙型肝炎病毒以筛 选携带鸭乙型肝炎病毒的麻鸭 分组后进行静脉葡萄糖耐量实验 分别提取携带 鸭乙型肝炎病毒麻鸭的肝 胰 肾和肌肉组织总 DNA 利用滚环扩增法检测肝 胰 肾和肌肉中是否存在鸭乙型肝炎病毒复制的标志分子共价闭合环状 DNA 用 SPSS 中的 ANOVA 分析麻鸭血糖与携带鸭乙型肝炎病毒的关系 以及血糖与鸭 乙型肝炎病毒在胰 肾和肌肉中复制的关系 结果结果 利用 PCR 筛选出 36 只携带 鸭乙型肝炎病毒麻鸭及 60 只阴性麻鸭 阳性率为 37 5 携带 DHBV 麻鸭的肝 胰 肾和肌肉其复制标志物共价闭合环状 DNA 的检出率分别为 100 55 6 66 7 44 4 携带鸭乙型肝炎病毒的麻鸭其空腹 0 5 小时 1 小时及 2 小时血糖浓度平均值均高于末携带鸭乙型肝炎病毒的麻鸭 肾和肌肉被 感染的麻鸭其血糖平均值略高于末感染的麻鸭 但均无统计学意义 胰腺被感染 的麻鸭其空腹 0 5 小时 1 小时及 2 小时血糖浓度平均值高于末感染的麻鸭 且 具有统计学意义 P 0 05 结论结论 乙型肝炎病毒肝外组织可支持乙型肝炎病毒 复制 乙型肝炎病毒感染胰腺可能是诱发糖耐量异常的原因之一 关键词关键词 乙型肝炎病毒 泛嗜性 血糖调节 HBV Replication in Extrahepatic Tissues and Impact in the Blood Glucose Regulation Abstract Object This study attempts to investigage whether the extrahepatic suports the replication of hronic hepatitis B virus HBV and whether HBV replication in extrahepatic infuences blood glucose regulation Methods The duck wth duck hronic hepatitis B virus DHBV were screened by amplified the DHBV DNA from the serum of duck the blood glucose regulation were evaluated by intravenous glucose tolerance test The total DNA of hepatic tissues pancreas kidney and muscle of duck with DHBV were extracted then using rolling circle of amplification to exame the the cccDNA of DHBV The relation between the blood glucose regulation and the DHBV replication in hepatic pancreas kidney and muscle was evaluated by the ANOVA Results Total 36 ducks were screened the positive for DHBV and 60 ducks were negative the positive rate of ducks with DHBV were 37 5 The detection rate of hepatic tissues pancreas kidney and muscle of DHBV cccDNA were 100 55 6 66 7 44 4 respectively The averages of blood glucose concentration of duck with DHBV were higher than the duck without DHBV includinf the blood glucose concentration of empty stomach half an hour 1 hour and 2 hour after injected sugar of blood glucose concentration of duck but there were no statistically significant the same results were observed in duck which cccDNA screened was positive in kidney and muscle The averages of blood glucose concentration of duck which cccDNA screened was positive in pancreas was higer than that cccDNA screened was negative and there were statistically significant P 0 05 Conclusions HBV can replicated in extrahepatic tissues and HBV infection pancreas are attributable to the impaired glucose tolerance Key words hepatitis B virus extrahepatic tissues blood glucose regulation 世界卫生组织统计全世界有 3 5 亿慢性乙肝病毒 hepatitis B virus HBV 感 染者 而我国属 HBV 感染高流行区 有 1 3 亿人 HBV 表面抗原阳性 每年因肝病 死亡人数约 30 万 1 3 慢性活动性肝炎可引发多种并发症 如肝源性糖尿病 肾 炎 消化系统病变等 4 5 其中肝源性糖尿病是乙肝患者常见的并发症 据研究 报道乙肝患者并发糖尿病的几率为 9 16 6 但其发病机制并不清楚 现有大量的科学研究证实在肝外组织可检测到 HBV 但由于乙肝病毒存在于 血液当中 各肝外组织检测到的 HBV DNA 是存在于各肝外组织细胞中还是存在 于肝外组织的血液中还无法明确界定 DHBV duck hepatitis B virus DHBV 和 HBV 均为嗜肝 DNA 病毒 它们 都有相似的基因组和病毒结构特征以及通过 RNA 逆转录复制的特性 由于 DHBV 不受宿主组织细胞来源的限制 因此 HBV 的复制机制的特点均基于对 DHBV 复制研究的基础之上 7 本研究拟以携带 DHBV 的麻鸭为实验动物 研究 肝外组织是否支持乙型肝炎病毒复制以及乙型肝炎病毒的泛嗜性对血糖调节的影 响 1 1 材料与方法材料与方法 1 11 1 材料材料 1 1 11 1 1 主要试剂主要试剂 QIAamp DNA Micro 试剂盒购自德国 Qiagen 公司 Taq DNA Polymerase 2 Taq PCR MasterMix 均购自北京天根生化科技公司 葡萄糖试剂 盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司 胰 RNase A 牛血清标准蛋白 质粒 DNA 小量抽提试剂盒 柱式 DNA 胶回收试剂盒及普通生物化学试剂均购自上海生 工生物工程公司 75 乙醇 无水乙醇购自于广东精细化学工程技术研究开发中 心 phi29 DNA Polymerase 购自 Fermentas 公司 克隆载体 pGEMTeasy 购自美国 Promega 公司 引物均由上海生工生物工程合成 1 1 21 1 2 引物引物 根据 GenBank 公布的 DHBV 基因全长序列 参考有关文献设计筛选携带 DHBV 麻鸭的引物 Ps1 和 Ps2 其扩增 DHBV 部分 S 基因 根据 DHBV 的高度 保守序列设计了 4 对 RCA 引物 RCA1 8 分别与 DHBV 的正负链互补 此外 设计了一对跨缺口扩增 DHBV 的引物 PK1 和 PK2 及设计了一对全长扩增 DHBV 的引物 DP1 和 DP2 引物序列及位置见表 1 均由上海生物工程有限公司 合成 表表 1 1 DHBVDHBV 引物序列一览表引物序列一览表 引物名称引物序列位置 Ps15 AGCTGGCCTAATCGGATTAC 3 nt1319 1338 Ps25 TGTCCGTCAGATACAGCAAG 3 nt1581 1562 RCA15 AATTCTCGAAATA C T 3 nt1361 1375 RCA25 GATCCGAGGGCAG T A 3 nt1668 1654 RCA35 CCAATGGGAGTCG G T 3 nt1610 1624 RCA45 TACACGTGGCAAA G G 3 nt2164 2150 RCA55 CTGTACCTTTGCC A C 3 nt2145 2159 RCA65 CCGCAATTCTTTC C A 3 nt1912 1898 RCA75 TAGAAGAAGAAAA G T 3 nt267 281 RCA85 AGTAAATGGTAAC A C 3 nt2005 1991 PK15 CCAACACATGGCGCAATATC 3 nt2180 2199 PK25 GCCTAAAGGTATCTCCTCAG 3 nt2958 2939 注 为硫代修饰碱基 1 21 2 方法方法 1 2 11 2 1 鸭血清中鸭血清中 DHBVDHBV 的提取及检测的提取及检测 翅静脉采集麻鸭的全血 分离血清 取 100 L 血清沸水浴 10 min 后 12 000 g离心 10 min PCR 反应体系为 2 Taq PCR MasterMix 12 5 L 10 mM 引物 Ps1 Ps2 各加 0 5 L Taq DNA Polymerase 0 5 L 上述上清液 5 L 加无菌双蒸水至 25 L 扩增条件为 94 3 min 94 30 s 56 40 s 72 30 s 共 35 个循环 72 7 min 68 10 min 以筛选携带 DHBV 的麻鸭 扩增长度为 262bp 1 琼脂糖电泳检测结果 1 2 21 2 2 静脉葡萄糖耐量实验静脉葡萄糖耐量实验 将麻鸭饥饿过夜后 称量麻鸭重量 计算并准备好需要注射的葡萄糖 翅静 脉采集麻鸭的全血后 注射准备好的葡萄糖 记下时间 之后再在 0 5h 1h 及 2h 时采血 4000 rpm 离心 10 min 取上清液至另一离心管 按照葡萄糖试剂盒 氧化酶法 的说明书测血糖浓度 剩余血清置于 20 保存备用 1 2 31 2 3 携带携带 DHBVDHBV 麻鸭各组织麻鸭各组织 DHBVDHBV DNADNA 的提取的提取 分别解剖每只携带 DHBV 的麻鸭 获取适量肝 胰腺 肾及肌肉组织 经 PBS 漂洗后 液氮保存 分别从这四种组织中提取 DHBV cccDNA 操作步骤按 QIAamp DNA Micro 试剂盒说明书进行 置于 20 保存备用 1 2 41 2 4 滚环扩增滚环扩增 分别取 8 5 L 麻鸭血清 DHBV DNA 肝组织总 DNA 及肝组织 DHBV DNA 为模板 加入 29 DNA Polymerase buffer 1 L 4 对 RCA 引物混合液 10 mol L 0 5 L 混匀后入 PCR 仪 95 3 min 50 15 s 30 15 s 20 10 min 后放 置冰上 在上述产物中加入 29 DNA Polymerase buffer 1 L 4 对 RCA 引物混合 液 10 mol L 0 5 L BSA 5 mg mL 0 2 L dNTP 2 5 mmol L 1 6 L 29 DNA polymerase 10 U L 10 U 补足水至总体积为 20 L 混匀后放入 PCR 仪 30 18 h 65 10 min 1 琼脂糖电泳检测结果后 置于 20 保存备 用 1 2 51 2 5 跨缺口引物跨缺口引物 PCRPCR 扩增扩增 根据 DHBV 的正负链缺口设计跨缺口引物 PK1 及 PK2 引物序列如表 1 PCR 反应体系为 2 Taq PCR MasterMix 12 5 L 10 mM 引物 PK1 PK2 各 加 0 5 L Taq DNA Polymerase 0 5 L 上述 RCA 产物 1 L 加无菌双蒸水至 25 L 反应条件为 94 预变性 3 min 94 40 s 56 30 s 72 1 min 共 35 个循环 72 5 min 扩增长度为 779 bp 1 琼脂糖电泳检测结果 2 2 结果结果 2 12 1 鸭血清中鸭血清中 DHBVDHBV 的提取及检测的提取及检测 以 PCR 方法筛选 96 只麻鸭 检测出 36 只血清中携带 DHBV 的麻鸭 阳性 率为 37 5 部分血清检测结果如图 1 扩增片段大小约为 262bp 阳性血清扩增 出正常的阳性条带 阴性血清无扩增条带 图图 1 1 PCR 筛选筛选 DHBVDHBV 阳性的麻鸭电泳图阳性的麻鸭电泳图 待测为部分待检测的麻鸭血清的扩增产物 和 分别为阳性血清的扩增 产物和阴性血清扩增产物 2 2 滚环扩增滚环扩增 以 RCA 方法扩增同一只阳性麻鸭的血清 DHBV DNA 肝 胰腺 肾和肌肉 组织的 DNA 部分实验结果如图 2 血清中 DHBV 以 rcDNA 存在 无条带 而 肝细胞中 DHBV 以 cccDNA 存在 有较好的扩增 与预期相符 图图 2 血清 肝 胰腺 肾和肌滚环扩增电泳图血清 肝 胰腺 肾和肌滚环扩增电泳图 2 3 跨缺口引物跨缺口引物 PCR 扩增扩增 分别从同一只麻鸭血清 DHBV DNA 肝 胰 肾和肌肉组织的 RCA 产物中 取 0 5uL 为模板 其中阴性对照以水为模板 用跨缺口引物 PCR 扩增 部分结果 如图 3 扩增片段大小约为 790bp 血清及阴性对照无条带 肝细胞扩增出阳性 结果 与预期相符 胰腺 肾及肌肉组织均扩增出阳性结果 经统计 从 96 只 麻鸭中检测出的 36 只阳性麻鸭 血清均无跨缺口引物的 PCR 扩增产物 肝组织 扩增出目的片段的概率为 100 与预期相符 胰腺 肾和肌肉中分别检测出 cccDNA 其中胰腺是 20 只 肾是 24 只 肌肉 16 只 胰腺 肾及肌肉检测到 DHBV cccDNA 的概率分别为 55 6 66 7 44 4 图图 3 血清 肝 胰腺 肾和肌跨缺口引物血清 肝 胰腺 肾和肌跨缺口引物 PCR 检测电泳图检测电泳图 2 42 4 葡萄糖耐量实验葡萄糖耐量实验 将 96 只麻鸭分组 以葡萄糖试剂盒测定麻鸭空腹血糖 0 5 小时 1 小时 及 2 小时血糖浓度 表一 麻鸭的阳性血清与阴性血清血糖检测表一 麻鸭的阳性血清与阴性血清血糖检测 单位 mmol L 数 量 空腹 血糖浓度 0 5 小时 血糖浓度 1 小时 血糖浓度 2 小时 血糖浓度 血清检测 阳性 36 只 10 5039 2 481 1 23 9848 6 887 5 15 8528 6 551 4 11 8626 5 556 9 血清检测 阴性 60 只 10 3121 1 346 6 22 4387 4 106 2 14 6595 3 062 8 11 0455 2 157 9 表二 携带表二 携带 DHBV 的麻鸭的胰腺的麻鸭的胰腺 cccDNA 检测阳性与阴性的血糖检测检测阳性与阴性的血糖检测 单位 mmol L 数 量 空腹 血糖浓度 0 5 小时 血糖浓度 1 小时 血糖浓度 2 小时 血糖浓度 胰腺 cccDNA 检 测阳性 19 只 10 9410 2 6 366 28 4289 7 793 6 20 0340 10 77 55 15 6533 10 72 25 胰腺 cccDNA 检 测阴性 17 只 9 2847 1 40 27 23 3241 2 513 2 12 6802 2 320 7 10 4185 1 784 2 表三 携带表三 携带 DHBV 的麻鸭的肾脏的麻鸭的肾脏 cccDNA 检测阳性与阴性的血糖检测检测阳性与阴性的血糖检测 单位 mmol L 数 量 空腹 血糖浓度 0 5 小时 血糖浓度 1 小时 血糖浓度 2 小时 血糖浓度 肾脏 cccDNA 检 24 只 9 8156 2 44 96 27 0572 7 814 0 17 6584 10 73 98 14 8143 9 901 6 测阳性 肾脏 cccDNA 检 测阴性 12 只 10 9835 1 8 808 24 3660 0 146 3 14 9801 2 204 0 10 3515 0 382 8 表四 携带表四 携带 DHBV 的麻鸭的肌肉的麻鸭的肌肉 cccDNA 检测阳性与阴性的血糖检测检测阳性与阴性的血糖检测 单位 mmol L 数 量 空腹 血糖浓度 0 5 小时 血糖浓度 1 小时 血糖浓度 2 小时 血糖浓度 肌肉 cccDNA 检 测阳性 12 只 9 8767 2 89 01 22 8390 2 810 2 12 8194 3 368 2 9 7249 1 0986 肌肉 cccDNA 检 测阴性 24 只 10 3690 2 1 267 27 8207 7 132 9 18 7388 10 07 98 15 1277 9 690 6 3 讨论讨论 目前对乙肝并发糖尿病发病机制主要有三方面的解释 外周组织产生胰岛素 抵抗 肝细胞损害造成肝功能障碍导致糖代谢异常及肝病病毒对胰腺的直接侵犯 或免疫损害 8 9 但其具体的分子机制并不清楚 时德仁等 10 11 报道 HBV 可影 响胰岛 细胞超微结构 并认为 HBV 可直接侵害胰岛细胞 是引起乙肝并发 糖尿病发病机制之一 共价闭合环状 DNA covalently closed circular DNA cccDNA 的形成是乙 型肝炎病毒侵入细胞后在细胞内进行复制的起始步骤 也是前基因组 RNA 复制 的原始模板 是建立病毒感染状态的最重要标志 故 cccDNA 可作为 HBV 复制 的重要指标 12 因 HBV 在血液中以 rcDNA 的形式存在 如在肝外组织中检测到 cccDNA 标志着此 HBV DNA 必然在肝外组织细胞中复制而不是存在于肝外组织 的血液中 我们建立了滚环式扩增法 rolling circle amplification RCA 13 检测 HBV 共价闭合环状 DNA covalently closed circular DNA cccDNA 的方法 14 15 并以此方法对携带 DHBV 麻鸭的肝 胰 肾和肌肉进行 cccDNA 检测 结果发现 除肝组织外 发现胰 肾和肌肉组织中存在 DHBV 的 cccDNA 证实了乙型肝炎 病毒确实具泛嗜性 可在肝外组织中复制 我们的实验证实胰腺被感染的麻鸭其空腹 0 5 小时 1 小时及 2 小时血糖浓 度平均值高于末感染的麻鸭 且具有统计学意义 P 0 05 但 DHBV 是否由于 感染了胰腺并在胰腺中复制表达其蛋白 影响胰岛素的分泌进而引起血糖调节受 损还有待研究 参考文献参考文献 1 Akbar DH Siddique AM Ahmed MM Prevalence of Type 2 diabetes in patients with hepatitis C and B virus infection in Jeddah Saudi Arabia Med Princ Pract 2002 11 82 85 2 赵英杰 熊良仲 高志文 对慢性乙型肝炎发病机制的再认识 J 华西医学 2004 19 2 345 3 沈松林 病毒性肝炎的肝外表现 J 山东医药 1998 38 8 42 43 4 Lin CY Hepat it is B virus deoxyribonucl eic acid in kidney cells probably leading to viral pathogensis among hepat it is B virus associated membranous nephropathy patients J Nephron 1993 63 1 58 64 5 Canem D Prince AM Hepatitis B virus infection Natural history and clinical consequences J N Engl J Med 2004 11 121 336 6 Wright T L Introduction to chronic hepatitis B infection J Am J Gastroenterol 2006 101 Suppl1 1 6 7 Technology Planning and Management Corporation Canterbury Hall Report on Carcinogens Backgr