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細胞學研究法報告 微生物學研究所碩一 94334007 陳桂貞培養基培養基依其來源及種類可分成天然培養基以及人工合成的培養基。天然培養基 天然培養基是指來自動物體液或利用組織分離提取的一類培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液、蛋白質水解產物、酵母抽取物等。組織培養技術建立早期，體外培養細胞都是利用天然培養基。但是由於天然培養基制作過程複雜、批間差異大，因此逐漸為合成培養基所取代。合成培養基 合成培養基是為了研究和了解細跑所需成分基礎所配製而成的，目的在於創造出與體內相似的生存環境。合成培養基有固定的組成成分，利於控制實驗條件標準化。合成培養基的應用極大的促進了培養細胞的發展。合成培養基已成為現今普遍使用的培養基。但合成培養基尚未成為十分完全的培養基，它只能維持細胞不死，不能促細胞增殖生長，使用時還需添加天然培養基，主要是牛血清。牛血清中含有促細胞增殖的各種生長因子和其它利於細胞生存的物質，因此當前使用合成培養基時尚需添加天然培養基。表1.天然培養基和合成培養基優缺點的比較天然培養基合成培養基優點營養成分豐富，培養效果好標準化生產，組分和含量相對固定。成本低缺點來源受限。成分複雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。一、合成培養基的種類人體內的細胞雖有共同的需要，但隨細胞種類不同又有所別。因此合成培養基的種類也很多。當然有的培養基原初雖為培養個別細胞所設計，而其適應性卻很廣，能適於很多細胞生長，RPMI 1640就屬這類培養基。不過在很多情況下，還應加以選擇，選擇的條件除理論上考慮個別細胞的持殊生理需要外，重要的是看其究竟能否使細胞生長增殖。所有合成培養基都含有一些共同成分，因此在組成上大同小異，差異在於基本成分量的變化和少數特殊成分的存在與否。最初，人們曾設想製備出不加任何天然成分的合成培養液。一開始有人試驗在生理鹽水中加入一些氨基酸或葡萄搪，發現可以延長雞胚組織存活的時間。1960年在此基礎上，“199”合成培養液間世，開始了合成培養液的歷史。“199”培養液含有69種成分，幾乎包括了所有的氨基酸、維生素和一些核酸衍生物、生長激素、脂類，加上硝酸鐵和Earle生理鹽溶液。這是一個較為複雜的合成培養液，曾被廣泛用作各類細胞的培養，但事實上如只用“199”進行培養細胞，僅能短期維持生存，細胞並不能長期生長和增殖，只有加了血清之後才能成為生長培養基。後來在“199”的基礎上，補加了還原劑、輔酶而省略了幾種B族維生素，改良成為“858”培養液。它可以在不加血清的情況下，能支持幾種細跑系較長時期地培養。與此同時人們又設計了一種更為複雜的NCTCl09培養液，它能支持許多細胞系的生長。雖然如此，在用這些培養基時，如果不加血清，對大多數細胞來說仍只限於維持生存，卻不能使細胞長期生長和增殖。且由於“199”和“109”等合成培養液由於成分較為複雜，近年已很少使用。 目前常用的是後來設計的MEM Eargle培養液。它僅含有12種必需氨基酸、谷氨析胺和八種維生素，成分簡單，可廣泛適應備種已建成細胞系的培養。同時，易於添加或減少某些成分，也特別適於特殊研究的細胞培養工作。在它的基礎上，之後又改良成DMEM（DulboccoMEM）。DMEM增加了各成分的用量（加倍），葡萄糖用量可選擇高糖（1OOOmg/L）或低糖（4OOmg/L），低糖對於生長速度較快、附著性稍差的腫瘤細胞生長有利。高糖則特別適用於附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點的克隆培養效果較好，所以常用於雜交瘤技術中骨髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細跑的培養。RPMI1640也是一種常用的培養液，最初是針對淋巴細胞的培養而設計。問世後發現它能廣泛適應許多種類的細胞的培養，包括正常細胞和腫瘤細胞的培養，而且成分簡單，和MEM一樣，應用己極其廣泛。Mc-Coy5A和HamFl2是兩種特殊用途的合成培養液。Mo-Coy5A是一種為肉瘤細胞設計的培養液。發現它除適用於原代細胞培養、組織活檢的細胞及淋巴細跑生長外，還特別適用較難培養的細胞。HamF12是在HamFlO基礎上改良的，它們和其它合成培養液不同的是使用了一些微量元素的離子，如Cu2、Zn2、Fe3等。可以在血清含量較少（2一10）的情況下培養細胞，而且特別適用單細胞的培養，因此常用作單細跑克隆化培養。除上述幾種培養液外，還有許多種其它培養基，但特點不明顯，不再贅述。二、合成培養基的成分合成培養液的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子和一些其它輔助物質。（一）氨機酸氨基酸是組成蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液供給。這幾種氨基酸稱必需氨基酸。其餘氨基酸為非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或由其它物質轉化而來。培養液中都含有必需氨基酸，幾乎所有的細胞對谷氨西胺有較高的要求。細胞需要谷氨西胺賴以合成核酸和蛋白質，在缺少各氨西胺時，細胞生長不良而死亡。所以各種培養液中都含有較大量的谷氨西胺。谷氨西胺在溶液中很不穩定，應置-20冰凍保存， 用前加入培養液內。已含有谷氨西胺的培養液在4冰箱中貯存兩週以上時，還應重新加入原來量的谷氨西胺。細胞所能利用的氨基酸是L型的同分異構體，D型氨基酸不能被利用。雖然D型對細胞無毒性，但在配製時應盡量采用L型，尤其是幾種必需氨基酸。如果沒有L型氨基酸，只好使用DL混合型代替，所用的量應是L型的加倍。表2.合成培養液中氨基酸所使用的濃度必須氨基酸：細胞生長所需，無法自行合成 濃度(mM)L-Isoleucine0.4L-Leucine0.4L-Lysine-HCl0.396L-Methionine0.101L-Phenylalanine0.194L-Threonine0.403L-Tryptophan0.049L-Valine0.393L-Histidine-HCl-H2O0.2非必須氨基酸:細胞可自行合成濃度(mM)L-Alanine0.1L-Arginine-HCl0.6L-Asparagine-H2O0.1L-Aspartic Acid0.1L-Cystine-2HCl0.1L-Glutamic Acid0.1L-Glutamine2.0Glycine0.1L-Proline0.1L-Serine0.1L-Tyrosine-2Na-2H2O0.199（二）碳水化合物碳水化合物是細胞生命的能量來源，而有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸鈉等。（三）維生素維生素是維持細胞生長的一種生物活性物質，它們在細胞中大多構成脢的輔脢，對細胞代謝有重大影響。維生素分為水溶性和脂溶性兩大類，配製時很重要。水溶性維生素有硫胺、核黃素、泛酸、菸酸、菸醋胺、呲哆醇、呲哆醛、葉酸、氰鈷胺素（VBl2）、生物素、對氨苯甲酸、膽鹼和肌醇等。脂溶性維生素有維生素A、維生素D、維生素E、維生素K等。表3.維生素的種類與功能Vitamins功能D-Ca PantothenateB3傳遞acyl groupsCholine chlorideB4形成acetylcholine，傳導神經衝動Folic acid傳遞一個碳的代替物，特別是formyl和hydroxymethyl groups；DNA中，提供methyl group for thyminei-Inositol形成IP3，做訊號傳導Niacinamide形成NAD+、NADP+，Oxidation-reduction reactions involving two-electron transferPyridoxal HClB6Transfer of groups to and from amino acidRiboflavinB2Oxidation-reduction reaction involving one- and two-electron transferThiamine HClB1Transfer of two-carbon fragments containting a carbonyl group（四）無機離子無機離子是細胞的重要組成部分，並積極參與細胞的代謝活動。例如Na+,K+,Cl-可調控膜電位，Mg2+可安定細胞狀態，Ca2+可增加細胞的吸附性,作為訊號傳遞分子，H2PO4-與酸鹼值平衡有關，故為細胞內維持滲透壓、訊號傳遞及酸鹼值平衡等生理狀態的主要離子。有的培養液中還含一些微量元素如Fe2、Zn2、Cu2離子等。Sodium bicarbonate的加入只有平衡配製完成的培養基的pH值。而細胞培養期間，使細胞處於適合的pH值的環境是HEPES、Sodium bicarbonate、和CO2來達成。簡而言之，HEPES是為了NaHCO3而加入，而CO2是為了NaHCO3而存在。此三者共同維持細胞培養基的酸鹼值，使細胞處於合適的生長環境。（五）其他成分在較為複雜的培養液中還包含核酸降解物如嘌吟和嘧啶類，以及氧化還原劑如抗壞血酸、谷胱甘太等。有的培養液中還直接採用了三磷酸腺甘（ATP）和輔脢A。細胞的培養基還會添加酚紅作為培養基的酸鹼指示劑。在培養基內添加酚紅可以監控培養基的成分及細胞的狀態變化。例如:由於細胞代謝會產生酸性物質使得環性偏酸，培養基呈黃色時，即可以更換細胞培養液。不過也有不添加酚紅的培養基，例如：因為酚紅具有螢光，能干擾螢光檢測，所以以流式細胞儀檢測螢光的細胞於培養基內不添加酚紅。另外酚紅與類固醇激素(如雄激素與雌激素等)有相似的結構，這在對腫瘤細胞研究時可能引起非特異性激素效應。因此作腫瘤細胞研究時培養基也不添加酚紅。另外，為了防止細菌污染，會在培養基內加入抗生素。抗生素比例須經過測試，否則會對細胞造成毒害，抗生素添加比例可見表4。表4.抗生素使用種類與濃度使用濃度保存溫度抗微生物之種類Penicillin100 unit/ml-20G(+)bacteriaStreptomycin100 g/ml -20G(+，-)bacteriaChlotetracycline50 g/ml-20G(+，-)bacteriaGentamycin50g/ml-20G(+，-)bacteriaMycoplasmaAmphotericicin B2.5g/ml-20Yeast，moldsNystatin50g/ml-20Yeast，moldsfungizone2.5g/ml-20Yeast，molds(六)血清 血清內含各式各樣的生物分子，各自具有不同的調節細胞生理生長的效果。有的能促進細胞生長，有的卻能抑制細胞生長。以下為血清所含的成分及其主要的功能：1. 生長因子(growth factor)EX. 表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，是常見生長因子的一種，促進表皮細胞、上皮細胞及間質的生長。 2. 賀爾蒙(hormones)可促進或抑制細胞的的生長和功能、並調控細胞的增殖和反應EX. 胰島素：促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，促細胞分裂。 腎上腺皮質激素:對淋巴球抑制其分裂生長對中性球促進其分裂生長3. 細胞附著延伸因子(attachment factor)細胞外基質的主要成分,提供細胞於培養皿上之附著及伸展EX. fibronectin4. 結合性蛋白質(binding protein:albumin)可結合低分子量的生物分子,並將攜帶之物質送入細胞內EX. transferrin攜帶鐵離子5. 脂類(lipid source)為構成細胞膜的基本成分EX. phospholipids6. 微量金屬離子(trace element)Cu, Zn, Co, Mo, Se血清中含有許多微量金屬離子,主要可與coenzyme作用,進行特殊的代謝路徑和功能 ,例如細胞內金屬酶需要Zn的參與，紅細胞運送氧氣和二氧化碳的酶。三、合成培養液的配製現今國內外都普遍使用市售商品粉狀合成培養基，除專門從事研究培養基者外，各實驗室己無必要再自己配製培養基。粉狀培養基是將各種培養液成分混合後製成，具有性質穩定、便於貯存和運輸、使用方法簡單等優點。具有維持細胞生存和代謝需要的效果，與傳統方式製備的合成培養基一樣好。粉狀培養基，因顆粒極細，很容易完全溶解於水，配製培養液方法極易掌握，只要按照說明書將規定重量的乾粉溶解在一定量的水中即可，或按比例配製，經過消毒滅菌後即使用。但應注意，不同廠家生產的同種產品其成分比例可能不全相同，配製方法也不同。有的培養基需加熱或通氣來幫助溶解，此外還應往意有的培養基成分不完全，要求另外加入補充成分，如谷氨西胺就是時常再單獨加入的成分。另外一般都不含NaHCO3，成分，也需配製時自行加入，但原則是配製過程中要使每一種成分都必須充分溶解和避免出現沉澱。所以在配制培養液時，要按照各種成分的性質、分組個別溶解，最後按比例和一定順序混合。掌握l2種粉劑的配法即可，其它大同小異。 （一）培養液的製備用乾粉製備培養液的過程如下，（1）製備出去離子水（2）加溫水至1630.C（3）把乾粉加人水中，攪拌令之溶解（4）加NaHCO3（5）加水至最終量（6）必要時用lN HCl或lN NaOH調節pH，因濾過時pH可能受影響（7）用0.22m或小於此微孔濾膜濾過消毒。（二）培養液的種類用各種合成培養基配制培養液時，尚需加一定量的天然培養基-血清，否則細胞仍難以長期生存和生長增殖，因血清中含有多種促細胞生長增殖和促細胞貼附因子，配製時跟據添加血清量的多少，構成作用不同的培養液，用於不同細胞和不同研究目的。1.生長培養液這是用以維持細胞生長增殖之用，含血清比例較大，是培養細胞工作中最主要的培養用液，其組成為基本培養基 8090 血清（多用小牛血清） 這是適用於一般細胞培養用液的組成，為培養特定細胞，一是要選擇適應性培養基，可能尚須添加基本培養基中缺少或該細跑需要的成分，2.維持液這是為維持細胞緩慢生長或不死的培養液，血清含量甚少。一般細胞因缺少生長因子時不能增殖，生常緩慢，但發生轉化或癌細胞因自身有產生促生長增殖因子的能力，雖在血清生缺少情況下仍能長，此維持液可用於選擇發生惡性轉化的細胞。基本培養基 9血清 25注意如培養正常細胞完全不加血清，可維持細胞不死，但時間過長細胞難免退化。四、無血清培養基目前，大多數動物細胞的體外培養，都不同程度地依賴血清才能生長增殖。天然培養基血清除了供給細胞的.營養成分外，還能促使細胞合成DNA，對細胞的增殖作用很大。實驗証明，提高血清的濃度，細胞生長的最大密度也隨之增加。現已清楚血清在體外培養細胞中的作用，主要是提供了細胞增殖所必需的生長因子。但與此同時，因血清的成分十分複雜，待別是對一些基礎理論研究，因使用血清之故也可能影響實驗結果。另外血清中也含有一定量的有毒物質和抑制物，對細跑有去分化作用的成分，能影響細胞功能。因此，許多研究工作需要培養基內不應含有血清和其它天然培養墓成分，如研究細胞生長因子、單克隆抗體的製備以及細胞分泌產物的研究等，都須應用無血清培養基來進行培養細胞。因此無血清培養投術日益受到人們的重視。早在50年代，一些細胞生物學家就曾試圖進行無血清細胞培養的研究。隨之設計了NCTCl09、135、MB752等成分較為複雜的培養基，它們都能支持L細胞系的生長。後來人們又發現在合成培養渡內加入一些胰島素，可以培養HeLa細胞。同時又有一些用於無血清的特殊培養基MCDB I09間世，可培養較多種類的細胞，如人成纖維細胞、腫瘤細跑和淋巴母細胞等。近年來無血清培養研究獲得很大進展，己有各種比較好的配方間世，可用於培養多種細胞。血清之所以能被廣泛用於各種細胞/原因是血清所含的促生長物不僅數量多而且種類全。凡體內各種細胞所需生長條件各不相同，要設計出一種萬能無血清培養基是非常困難的，而且也不一定有這種必要。因此當前無血清培養基的設計上有兩種發展趨勢，一是繼續設計新的、能適應較多種類型細胞體外生長增殖的培養基。這類無血清培養基雖不斷出現，但理想的並不很多。二是在研究生長因子等工作的基礎上，人工合成培養基內補加一定的激素、生長因子等已知物質來支持細胞的生長和增殖。補加多種成分主要有激素、生長因子、細胞附著蛋白、金屬離子轉移蛋白、細胞結合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制劑和微量元素等。無血清培養基由以下成分組成 （一）基礎培養基為無血清培養基的基礎溶液，很多種人工合成的培養基多使用的是HamFl2和DMEM培養液（二者以11相混合），然後再補加15mM的HEPES l.2g/升NaHCO3作為基礎溶液。然後根據不同細胞的要求，再補加其它附加成分。無血清培養基內由於缺乏天然成分中的大分子物質對細胞的保護作用，細胞生存在這樣的培養液中，對外界刺激耐受性較差。因而對配製溶液的蒸餾水要求較高，必須要使用高純度的蒸餾水。一般都要使用三次蒸餾以上的蒸餾水，而最後一次蒸餾應在配制製制備後立即使用。有人認為這是無血清培養的關鍵之一。（二）附加成份一般根據細胞的生長條件和實驗的要求，在基礎培養液內尚須添加一定量的其它成分。這些附加成分主要有三類，一類是細胞外基質（Extracellular MatrixECM）類，能幫助細胞附著和貼附。另一類是營養成分，是細胞生長和代謝所必需的。而第三類是促細胞生長增殖的生長固子。此外有時還需添加脢的抑制劑，以保護細胞不受培養基內殘留酶的損傷。目前常用的培養ECM主要有纖粘連蛋白（Fibronectin）、多聚賴氨酸（Polylysoine）配制濃度為lmg/mI，溶解在PBS中，一20保存）、膠原蛋白等。1.促貼壁附著成分血清中含有促細胞貼附成分，如培養基中不加血清，需補充這種物質。纖維粘連蛋白和層粘連蛋白便是這類能促細胞貼附物。纖維粘連蛋白的配制濃度為25ug一50ug/ml。用時先塗在培養瓶皿底物上，層粘連蛋白為lpg一5pg/ml，可直接加在培養液中。膠原不僅利於上皮細胞貼附成分，也是細胞外基質之一，對細胞的生長增殖也有重要作用。 2.促生長增殖成分無血清培養基中必須含有各種促細胞增殖成分，其確定是根據對細胞生長因子研究的結果，到目前為止還沒有完全統一的配方。仍然是各實驗室根據細胞種類不同確定的。但是，通常廣泛使用的成分有，轉鐵蛋白、硒酸鈉（Na2SeO4）、胰島素等。說明它們對大多數，細胞生長增殖有促進作用，也許是它們比較容易獲得。其它一些生長因子和激素等，則是根據個別細胞生長的要求而確定。各種成分通常配製成貯存液，按用量大小分裝保存，避兔多次凍融。配製方法和使用濃度詳見表5。 3.蛋白脢抑致物 .對於貼壁生長的細胞來講，做繼代培養時仍需要借助胰蛋白質的消化作用。由於無血清培養缺乏對細胞的保護劑，殘余的脢對細胞的損傷是十分嚴重的。現巳有報告長期用無血清培養會改變細跑的某些持性。因而無血清培養必須使用脢的抑制劑。目前常用脢抑制劑是大豆胰蛋白脢抑制劑（Soybean Trypsin Inhibitor），使用的濃度為0.1%0.5%，通常配制在DMEM/Fl2的基礎培養液內。使用的方法有兩種，一種是在胰蛋白脢作用後的單層細胞中加入適當的扣制劑，以中止胰蛋白脢的作用，但火候不易掌握。另一種是將抑制劑加入無血清培養基內，以中止殘餘脢的作用，這種方法筒便易行。大豆，胰蛋白脢抑制劑可經過濾菌後，置一20保存。表5.附加生長成分的配製和使用成分名稱溶劑貯存液濃度貯存溫度 （）使用濃度胰島素0.0lN HCllmg/ml45ug/ml轉鐵蛋白PBSlmg/ml-205ug/mlNa2SeO4H2O10-6M410-810-10M三碘甲狀腺原胺酸0.02N NaOH5X10_7M-206X10_12M表皮生長因子（EGF）H2O2um/ml-201ng/ml成纖維生長因子 （FGF）H2O2ug/ml-205ng/ml神經生長因子 （NGF）H2O2ug/ml-205ng/ml生長激素 （GH）H2O2ug/ml-205ng/ml氫化可的松95酒精2X10-4M-42X10-6M維生素A酸95酒精2X10-6M-202X10-8M胰高血糖素0.01N HCl0.01mg/ml-20500ng/ml去脂牛血清白蛋白DMEM/F1210-3M-2010-5M乙醇胺DMEM/F1210-3M-205X10-5M油酸或亞油酸無水乙醇10-3M-2010-5M(本表是根據各實驗室報告總合而成，僅供參考。除上述成分外，還有前列腺素El（26ng/ml）、促腎上腺皮質激素（5ug/ml）、促黃體生成激素（5OOng/ml）等。去脂牛血清白蛋白迢常和脂肪酸（乙醇胺，油酸）11混合使用。)（三）無血清培養基的制備 無血清培養開始使用的時間還不長，完全通用的無血清培養基尚處在研究階段，然而已開始有商品供選擇，如MCDB系列無血清培養基、Ultroser G等。以Ultroser G為例，它包括有生長因子、附著因子、微量元素、激素、連結素、維生素等六種物質，此外還含有抑制胰蛋白酶因子，便於用胰蛋白酶傳代。如MEM Iscove是一種粉劑無血清培養基，在MEM的基礎上外加有轉鐵白蛋白、牛血清蛋白和黃豆脂質（Soybean Lipids），也是一種較好的無血清培養基。我國無血清培養研究也取得很大進展。毫示疑間，無血清培養基有根大的實用價值，而且是可行的，一定會得到更進一步的發展。但由於當前尚缺少廣泛使用的無血清產品，在所需附加物有限的情況下，也可自行配製。培養用的ECM有時可以直接加入培養基內，但更經常的是使ECM貼附在細胞生長底物表面，用玻璃或是無毒的塑料材料均可。製備過程要在嚴格無菌條件下過行，具體制備程序如下1. 選則適宜的培養基質（ECM），按上述條件先製備成貯存溶液， 2. 使用前，貯存溶液用高純度的蒸餾水稀釋成0.lmg/ml濃度的使用液， 3. 使用液用0.22um孔往的微孔濾膜過濾除菌， 4. 用吸管吸取使用液，均勻塗於消毒滅菌的細胞培養器皿的細胞生長表面。使用液的用量可按每平方厘米表面加50u1的溶液，為保証其表面全部彼溶液浸濕，用量可適當增減， 5. 室溫下靜置5分鐘（使用膠原做基質時，可適當延長時間至24小時），然後吸出多餘的溶液， 6. 再用滅菌蒸餾水（100ul/cm）洗滌塗有ECM的表面，然後盡量將水分吸凈烘乾 7. 很據不同細胞生長持點，接種適宜濃度的細胞進行培養。實驗室生物安全等級生物安全等級一：1.適用於使用之生物不會使健康人致病、對實驗室工作人員及環境具最低潛在危險。如：大腸桿菌。2.工作可依照標準微生物操作準則，在開放的實驗桌上進行，不需特殊設計的污染防護儀器設施。3.實驗室無須與其他作業區域分離。一般而言，實驗室工作人員，必須接受實驗操作的特別訓練，並由具備微生物(或相關知識)使用須知訓練的實驗室主管或有相關經驗者所管理。生物安全等級二：1.用於中度潛在危險的病原。病原與人類疾病有關，可能有皮膚接觸、誤食及黏膜暴露。如：金黃色葡萄球菌。2.與等級一差別在 (1)實驗室工作人員受過使用致病物質的特殊訓練並由適當的專家所指導。 (2)工作進行中需管制門禁。 (3)特別小心受污染的尖銳物品。 (4)操作步驟可能產生氣霧或濺灑者，需使用生物安全操作櫃或物理性防護設備。生物安全等級三： 可經氣霧傳播之本土或外來病原，會嚴重危害健康。適用於臨床、診斷、教學、研究單位、工作人員必須接受處理致病性及致命生物的特別訓練，並由具經驗之專家監督管理，所有步驟必須在生物安全操作櫃中進行，並使用其他物理防範裝置及工作人員穿配保護性衣著與裝置。實驗室需經特殊設計(如緩衝區、密封通道、定向氣流等)。故需遵守標準微生物操作、特殊操作及安全設備規範才能符合等級三之需要。如：SARS病毒。生物安全等級四： 適用於可經由氣膠傳播或未知傳染危險之危險生物病原，會引起對生命之高度危機的疾病。實驗工作人員必須接受極度危險之感染性物質的特別訓練，需充分了解標準及特殊操作、設備、實驗室的設計特色。並嚴格管制實驗室門禁，所有活動皆限於生物安全操作櫃中，工作人員穿著正壓工作服及呼吸器，實驗室具特殊設計可有效防止微生物散佈至環境中。實驗室設於不同棟或同棟建築內的管制區域，完全與其他區域隔離。如：依波拉病毒。生物安全櫃種類、選用依據及操作安全介紹在微生物學級生醫實驗室生物安全一書中，將各式安全櫃依適用的生物危害層級分為三級，其中第二級的生物安全櫃依美國2002年最新修正的第二級生物安全櫃標準NSF /ANSI 49又分為A1、A2、B1、B2四種型式。應注意的是，各式安全櫃用以保證排氣乾淨的HEPA FILTER雖可以有效的阻止粒狀物，例如具感染性的病原媒介等，但無法阻止易揮發性的化學品或有機氣體，因此若操作物含易揮發性的有毒化學品時，應有適當的排氣系統將氣體排出至外界。(1)第一級安全櫃第一級安全櫃結構設計如圖1 所示，其使用目的在於保護人員及環境，但並不提供對櫃內操作物種（實驗試料、產品等）的潔淨保護。櫃體在排氣口處設有HEPA FILTER，以避免安全櫃內操作物質未經處理排出後污染環境。而在操作人員保護方面，生物安全櫃主要是藉櫃體內的氣體流場來進行操作物與人員的隔離，因此在操作區需保持最小的送風速度至少應達到0.38 m/sec (75 ft/min)。由於無法提供櫃內操作物種的潔淨保護，目前各生技相關產業中第一級安全櫃的使用已逐漸減少，多為被用於密閉的設備，如離心機、小型發酵機或伴隨有潛在產生大量氣膠的製程中使用。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。A. 視窗開口(front opening) B. 視窗(sash)C. 排氣HEPA FILTER(exhaust HEPA filter)D. 排氣室(exhaust Plenum)E. 工作臺面F. 格狀開口(grille)圖1 第一級生物安全櫃構造圖(2)第二級安全櫃第二級安全櫃結構設計如圖2至圖5 所示，型式分為A1、A2（原B3）、B1、B2，主要針對無菌的動物組織、細胞培殖與病毒繁殖的試驗操作，因此安全櫃需提供櫃內操作物的潔淨保護。其防護原理是以櫃內層流配合HEPA FILTER的使用來提供一個無菌的操作環境，此級安全櫃可提供人員、環境及產品三層面的保護。安全櫃運轉時，氣流經前方開口由外界引入於操作區內，用以保護人員不受操作物逸散的污染，流入操作區的外氣隨即被風壓引導流入循環室，以不流經過試料為原則，藉以保護試料產品的安全。排氣則需通過HEPA FILTER，可以被再循環回實驗室裡（型式A的安全櫃）或被排出至建築物外（型式B的安全櫃）。而後，流經HEPA FILTER到操作區的氣體流場需提供試料保護、隔離外氣及排出氣膠的功能，以將安全櫃工作臺面的交叉污染減到最低。此級安全櫃依不同防護需求，可適用於生物安全第一、第二與第三級實驗室內。1.第二級，型式A安全櫃：又分為A1及A2兩種，結構設計如圖2及3 所示。兩者結構極為相近，不同在於A1安全櫃要求風機在安全櫃所應提供於視窗開口氣流速度最小量或量測平均量應至少0.38 m/sec(75fpm)，而A2安全櫃要求則為0.5m/sec，且A1由於風機位置置於櫃體下方，造成櫃內通道皆處於正壓型態，若櫃體構造有所破損時，極容易造成洩漏而污染實驗室環境。型式A安全櫃氣體的循環比一般為30%經排氣口HEPA FILTER排除、70%通過回風HEPA FILTER再循環回到工作區，大部分此類型安全櫃設有調節閥，可以調整30%與70%的氣流分配。另外應注意的是，無裝設排氣導管的A型式安全櫃不可使用在易揮發性或有毒化學物質的實驗上，若排氣有污染環境之虞時，應使用可拆卸式的套管環繞氣罩部分，將排氣排出建築物外，且排氣流量必須足夠維持安全櫃操作面進氣與HEPA排氣間的氣體流動。 A. 視窗開口 B. 視窗C. 排氣HEPA FILTERD. 供氣HEPA FILTER(Supply HEPA filter)E. 後氣室(Rear plenum)F. 風機圖2 第二級A1型生物安全櫃構造圖A. 視窗開口B. 視窗C. 排氣HEPA FILTERD. 供風HEPA FILTERE. 正壓氣室(Positive pressure plenum)F. 負壓氣室(Negative pressure plenum)圖3 第二級A2（原B3）型生物安全櫃構造圖2.第二級，型式B安全櫃：又分為B1、B2兩種，結構設計分別如圖4、5及圖6 所示。此類型第二級安全櫃發源自國際癌症學會(National Cancer Institute)，其被設計用來進行玻璃試管內的操作微量危險化學品，與型式A安全櫃最為不同的地方在於其一定直接或接管於室外排氣，同時回風比例亦較形式A低，即大部分使用後氣流不再過濾循環使用，甚至B2為完全無循環氣體使用。一些生物醫療的研究需要使用到小量危險的化學製品，如致癌化學蒸汽等，這些物質應當被操作在穩定的氣流區間（如層流空間）以隔離人員，並在操作區的排氣導管中連結氣罩並過濾至建物排氣系統中釋放。B1型式的安全櫃具有附加的HEPA FILTER以消除由操作區產生的微粒與化學物質對下游風機的污染。操作區的下吹氣流至少需達0.5 m/sec或以上，氣流到工作檯面分離後應有70%的氣體流入後方格狀開口的設計條件，其餘30%的氣體(含外氣流入部分)進入前方格狀開口的回風室中。該型式安全櫃必須連結排氣導管，最好有與空調排氣系統分離的專屬的排氣系統，建議建物的排氣系統中具備獨立的壓力監視器，在排氣端應裝設失效警鈴，並由安全互鎖裝置連接安全櫃以切斷供風扇電力。其結構設計上另有Bench Top型，就是設計將風機安裝於安全櫃上方(圖5 )，同樣可提供與基本型相同的保護。型式B2的安全櫃為100%排氣，無再循環使用，供氣需達操作區的下吹氣流至少0.5 m/sec以上，當試驗中使用的化學藥品會侵蝕HEPA濾材、框架等物件時，可考慮使用此類型以減少迴風濾材上的消耗。為了維持嚴格的安全操作方式，實驗室人員使用型式B的安全櫃進行試驗時，連結安全櫃排氣導管的排風風機應連接至緊急的供應電源，目的在斷電下仍能有足夠電力排出危害氣體至排氣系統中，避免洩漏進入實驗室造成人員危害。A. 視窗開口 E. 負壓排氣室(Negative pressure exhaust plenum)B. 視窗 F. 風機C. 排氣HEPA FILTER G. 附加排氣HEPA FILTERD. 供風HEPA FILTER (Additional HEPA filter for supply air)圖4 第二級B1型生物安全櫃構造圖（基本型，本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）A. 視窗開口B. 視窗C. 排氣HEPA FILTERD. 負壓排氣室E. 供風HEPA FILTERF. 風機G. 供風室(Supply plenum)圖5 第二級B1型生物安全櫃構造圖（Bench Top型設計，本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）A. 視窗開口B. 視窗C. 排氣HEPA FILTERD. 供風HEPA FILTERE. 負壓排氣室F. 風機G. 供風分佈口(Supply Diffuser)圖6 第二級B2型生物安全櫃構造圖（本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）(3)第三級安全櫃第三級的生物安全櫃結構設計如圖7 所示，其使用時機在於操作被歸類於生物安全第四級的微生物試劑，通常安裝於已經管制出入、特殊通風或特殊防護系統的最嚴格污染控制實驗室內。安全櫃的內部需為一個漏氣率低於10-5ml/sec的封閉空間，並含一個封閉的觀察視窗，對於試料在此封閉的安全櫃是採取通過一浸水槽（可穿過安全櫃臺面）或雙層門的開口箱（如一雙門滅菌鍋）方式進出。此型式安全櫃的供給與排出氣體均需經過HEPA FILTER過濾。對外排氣時，氣壓應受安全櫃外部的專用獨立排氣系統所控制，以保持安全櫃任何時刻均在負壓狀態下，負壓值通常約為0.124 kPa。此類型安全櫃的實驗操作為利用附加於安全櫃窗口的密封橡膠手套進行，以避免使用者直接接觸危險的物質。A. 手套端的O形環(glove ports with O-ring for attaching arm-length gloves to cabinet) B. 視窗C. 排氣HEPA FILTERD. 供風HEPA FILTERE. 兩頭型滅菌鍋或傳遞箱(Double ended autoclave or pass-through box)Note: 在安全櫃中化學浸泡槽應被裝置在工作臺面之下。圖7 第三級生物安全櫃構造圖（本型安全櫃的排氣需連接至建築物的排氣系統）三、生物安全櫃之選擇與使用生物物安全櫃對人員、環境與操作物所提供的保護依其等級不同而有所差異，表2為上述三種等級安全櫃之特性列表整理，包括了最為基本的操作面速度要求、適用物質型態等，而表3則為使用場所的生物安全等級與應選用安全櫃等級的對照表，可供使用者作一快速比對參考。表2 各型式生物安全櫃的特性比較安全櫃等級操作面風速（m/sec）空氣流動型態適用型態非揮發性有毒化學品及放射性物質揮發性有毒化學品及放射性物質I0.38排氣經由HEPA FILTER連結排氣系統到建物外面或經由HEPA FILTER進入房間可可II, A10.3870%經過HEPA再循環至工作區30%利用平衡閥經由HEPA經由導管排至外界可（微量）否II, A2（B3）0.50循環機制同A1排氣管路與氣室、循環管道需設計為負壓可可（微量）II, B10.5030%經過HEPA再循環至工作區70%利用平衡閥經由HEPA經由導管排至外界安全櫃之排氣需經由專用導管排放至外界且必須通過HEPA FILTER可可（微量）II, B20.50無循環氣流，所有排到外界的氣體需通過HEPA FILTER可可（小量）IIIN/A排氣口處需經兩個過濾器處理可可（小量）表3 生物安全櫃等級的選擇實驗室生物安全等級(Biological safety Level, BSL)應選用的安全櫃等級所能提供的保護人員試品環境1 3I可否可1 3II（A1,A2 B1,B2）可可可4III可可可三、生物安全櫃操作注意事項(1)使用前準備在於安全櫃工作之前，應事先準備一份物料需求清單，並將所需要的物料儘可能的先置於安全櫃內，以使在安全櫃內的手部移動次數能減到最小，且為避免因為手臂移動破壞櫃內脆弱的空氣屏障，減弱安全櫃之保護性能，移動時動作不宜過快，方向儘可能垂直於開啟門的表面。開始工作之前應先以70%酒精擦拭操作檯，同時於操作前開啟安全櫃內的抽氣機至少3至5分鐘以淨化安全櫃內殘留氣膠或微粒，操作人員應穿著實驗衣並配戴橡膠手套以保護手部，手套必須戴超過實驗外衣的袖口，調整坐椅高度至臉部高於安全櫃前端對外開口。為避免放置於安全櫃內的器具或試料造成櫃內氣流的干擾而引起防護氣流的失效及交叉污染效果，因此多餘的用品應置於櫃外，櫃內只應有工作期間所需要的物品。此外，物品擺置應盡可能於操作檯面後半段，且須遠離兩端的格狀開口，容易產生氣膠的藥品或設備（如混合器、離心機等）應置於臺面的最遠端，試驗樣本等擺放則主要以使供氣氣流由低污染流向高污染試料區為原則。(2)使用中操作所有操作必須在前方格狀開口後緣至少10公分處進行，具有潛在危害的物質應事先經過消毒處理程序或密封後無外洩之虞後才能移出櫃外，安全櫃操作者應受過安全訓練或具有良好微生物處理技術與經驗，以降低操作者暴露於傳染性疾病樣本的潛在危險。操作試驗時，打開的管子或瓶子勿以垂直的方式握住，研究人員進行組織培養皿有關的工作時應握取無菌面上方的蓋子以減少向下氣流的直接衝擊，打開的容器應儘速在將其關閉，以減少交叉感染的機會。在安全櫃應儘能避免進行物質燃燒的操作，因火焰會產生自然對流使層流受嚴重干擾而造成污染的擴散，因此如種菌時接種環滅菌等需火源動作，可考慮以一種接觸平面式(touch-plate)的微燃燒器取代。(3)使用後清潔受污染的物料以櫃中預置的生物污染防治袋收集後密封，再移置滅菌設備殺菌後丟棄，生物櫃操作臺面、櫃體內壁及視窗內部玻璃則以70%濃度的酒精或是用1:100稀釋的家用的漂白劑加以擦拭，或是使用針對某些特別試驗操作所使用的其他消毒劑清潔之，當使用漂白劑時，最好再以無菌水（sterile water）進行次清潔擦拭，以避免殘留下來的氯造成不銹鋼表面腐蝕。若試驗中不慎污染了安全櫃前後的格狀開口，則整個清潔工作必須包括櫃內所有物品及安全櫃內部，而在執行傳染性病菌的試驗工作後，更換HEPA FILTER或進行內部維修工作前則必須先進行HEPA FILTER的清潔工作，最常使用的方法為使用甲醛（formaldehyde）進行整個櫃體的燻蒸殺菌。(4)其他特殊需求A.排氣系統等週遭設施在生物安全第三級與第四級的實驗室中，生物安全櫃廢氣的排放必須直接以獨立導管輸出經過濾後排放至建築物外，排出的氣體須經HEPA FILTER過濾，這些裝置及過程在四級實驗室是絕對必要的，但在三級實驗室則有可選擇性。另外，當安全櫃的排氣室靜壓發生改變時，建築物排氣系統的設計在進行氣體排除時亦須有足夠能力去處理所有的排放氣體，若建物排氣系統無法達成此一要求時，則每一個安全櫃必須有專用的獨立排氣系統。雖然生物安全櫃被認為是處理具傳染性物質的主要安全屏障。但是實驗室本身應具有其它次級屏障的防護措施，例如藉由實驗室負壓以建立室內的向內流動氣流，實驗室內空氣由緊鄰的空間或前室提供等等，這些需求在生物安全第二級的實驗室中為可選擇性的，但是在第三級實驗室中則為必要，所有設備的氣流平衡必須達成來確保氣流從污染最小的區域到污染最大的區域。而安全櫃內的電力系統必須連接地線且為獨立供應之電源，所有非電力的公用設施最好裝置在櫃體外部，並設有易於操作的關閉閥門。當櫃內試驗需使用易燃性氣體時，為防止火災發生，櫃體外側應設有緊急使用的氣體關閉閥，而在操作生物危險性較高的試驗，應儘可能避免於安全櫃內使用壓縮空氣系統，以避免高壓容器失效而引起危害氣膠散逸的潛在危機。若安全櫃有使用紫外線(ultraviolet, UV)燈具，每週應進行清潔以防止因為灰塵或污染物的累積而降低了殺菌功能，亦應定期量測其UV光線的強度以確保其殺菌效果，UV燈具開啟作用時，人員應避免於櫃體開口面區域活動，以保護人員眼睛及皮膚健康。B.生物安全櫃設置位置建議安全櫃周邊的前後左右都能預留足夠的空間以利該設施進行操作及維護。安全櫃的擺放應確保實驗室的循環氣體不至