双水相萃取脂肪酶

双水相萃取脂肪酶双水相萃取脂肪酶 摘要 摘要 本实验主要研究用双水相萃取法分离和提纯脂肪酶的技术 探究了双水 相的形成条件及不同浓度的双水相体系对脂肪酶的提纯效果 同时也介绍了一 些蛋白质含量及酶活检测的基本方法 前言前言 脂肪酶 Lipase EC 3 1 1 3 是一种能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶 在生物体内是一种重要的代谢酶 在食品加工 新型生物材料 生物传感器 生物医学以及环境 能源等领域也有非常广泛应用 1 2 工业上常用的脂肪酶大多是由微生物发酵得到 但是发酵得到的只是含 有杂质较多的粗酶液 要得到能够满足工业生产要求的脂肪酶还需要经过进一 步的分离和纯化 现在用于脂肪酶分离纯化的方法大多是常见的蛋白质分离方 法 比如各种层析 电泳以及离心等方法 但是在酶的分离过程中还需要考虑 到保持酶活 提高回收效率以及降低成本等因素 一般的分离方法对酶的分离 提纯的效果并不很理想 所以寻找一种高效实用的提纯方法对脂肪酶在工业生 产中的应用是非常重要的 双水相萃取技术是近年来基于液 液萃取理论并考虑保持生物活性所开 发的一种新型分离方法 是利用生物大分子物质在由高聚物 高聚物 水或者高聚 物 无机盐 水形成的体系中的分配系数不同而实现对生物大分子的分离的 1956 年 瑞典 Lund 大学的 Albertsson 首次利用双水相萃取技术来分离生物物质 研 究了蛋白质 核酸 病毒 细胞及细胞颗粒在双水相体系中的分配行为 这是 双水相萃取方法在生物大分子分离提纯中的最早应用 3 国内对于双水相萃取 方法的研究也早在 20 世纪 60 年代就已经开始了 与传统的蛋白质分离提纯方法相比 双水相萃取方法具有很多优点 体 系含水量高 可达 80 以上 蛋白质在其中不易变性 界面张力远远低于水 有机溶剂两相体系的界面张力 一般为 0 5 10 4mN m 1 有助于强化相际间的 质量传递 系统中的传质和平均速度快 能耗小 分相时间短 一般只要 5 15min 易于放大和进行连续性操作 萃取环境温和 生物相容性高 聚合 物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等 4 5 双水相萃取的方法在蛋白质 酶 核酸 氨基酸 多肽 细胞器等产品的分离和纯化等领域中得到了广泛的应用 所以这种分离方法在蛋白质以及酶的分离提纯中有着很大的应用前景 现在研究最多的双水相体系有高聚物 高聚物以及高聚物 无机盐体系 常 用的高聚物有聚乙二醇 PEG 和葡聚糖等 无机盐主要有磷酸盐 硫酸盐等 本实验所采用的就是 PEG 硫酸盐体系 另外对于一种不是很常见的双水相体系 表面活性剂双水相体系也做了一些探究 一 实验原理 双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两种物质所形成的双水相 中的分配系数的不同而进行分离的 当双水相体系中的两种物质浓度达到一定 比例时 就会形成两个稳定的且互不相溶的两相 由于脂肪酶在这两相中的分 配系数不同 就会自动的向分配系数高的一相中移动 而其它的杂质则分配到 另一相 这样就达到了分离提纯的目的 由于两相都是水相 所以一般对于酶 的活性及稳定性不会有太大的影响 为了得到适合的两相配比 就要通过绘制相图来进行分析 相图的绘制 就是通过调整两相比例 得到能够分相的临界点 从而得到相图 蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法 利用考马斯亮蓝进行染色 然后 检测吸光度 对照标准曲线即可得到蛋白质含量 酶活的检测方法则有滴定法和 pNPP 法 滴定法是以橄榄油乳化液为底 物 通过检测脂肪酶水解橄榄油得到的脂肪酸来确定其活性 而 pNPP 法则是 利用脂肪酶水解 4 硝基苯基磷酸二钠盐 pNPP 得到有颜色的对硝基苯酚 pNP 11 然后通过分光光度计检测其吸光度 对照标准曲线得到酶活 脂肪酶经过双水相的初步分离后 还要通过凝胶过滤的方法对其进行进 一步的分离和纯化 从而达到更高的纯度 但是经过双水相后 体系中有大量 的 PEG 脂肪酶主要分配在 PEG 相 从而不能直接经过凝胶过滤 还需要采取 一定手段去除过量的 PEG 可以采用 PEG 沉淀的方法或者反萃取来去除多余的 PEG 本实验采用的是 PEG NH4 2SO4体系和 SDS CTAB 体系两种双水相 PEG NH4 2SO4体系是较为常用的一种双水相体系 以前也有人做过相关的 研究 证明这种体系对于脂肪酶的分离提纯效果比较好 6 8 SDS CTAB 体系 是一种表面活性剂双水相体系 国内也有对此类双水相体系的分配行为及在蛋 白质及氨基酸等大分子物质的分离提纯中的应用 但并没有人将其用于脂肪酶 的分离提纯 9 10 二 实验用品 实验材料 假单胞菌脂肪酶 由假单胞菌发酵制备 实验仪器 紫外可见分光光度计 离心机 乳化机 恒温摇床 恒温水浴锅 PH 计 实验药品及配制方法 PEG1000 NH4 2SO4 十二烷基硫酸钠 SDS 十六 烷基三甲基溴化铵 CTAB 橄榄油 2 聚乙烯醇 PVA 溶液 糊精 蛋白 胨 K2HPO4 3H2 O MgSO4 7H2 O 0 05mol L NaOH 溶液 酚酞指示剂 EDTA pNPP 乙腈 Tris HCl PH8 5 称取 6 055gTris HCl 溶于约 800ml 蒸馏水中 用 HCl 调 节 PH 至 8 5 定容至 1000ml 即可 橄榄油乳化液 将 2 PVA 溶液与橄榄油按 3 1 的比例进行混合 在乳化仪上 以 3000r min 的速度乳化 每次 3min 重复乳化 3 次 发酵培养基 0 5 糊精 1 5 蛋白胨 0 18 K2HPO4 3H2O 0 07 MgSO4 7H2O 0 14 尿素 2 橄榄油乳化液 调节 PH 8 4 左右 接种量 2 考马斯亮蓝 考马斯亮蓝 G 250 100mg 溶于 50ml 95 乙醇 加入 100ml 85 H3PO4 用蒸馏水稀释至 1000ml 抽虑出去杂质 最终试剂中含 0 01 W V 考马斯亮蓝 G 250 4 7 W V 乙醇 8 5 W V H3PO4 标准蛋白溶液 纯的牛血清血蛋白 预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量 根据其纯度同 0 15mol LNaCl 配制成 100ug ml 蛋白溶液 pNPP 底物 将 pNPP 溶于乙腈中使终浓度为 10mmol L 依次加入乙醇和 50mmol L Tris HCL 缓冲液 PH8 5 使乙腈 乙醇 Tris HCl 体积比为 1 4 95 由于该溶液很不稳定 需要现配现用 保存时则是不加 Tris HCl 置 于 20 下保存 三 实验方法 1 双水相相图的制作 12 13 PEG NH4 2SO4体系双水相相图制作方法 根据 Albertsson 的方法绘制相图 取一定量的 40 的 PEG 原液置于试管中 然后加入 40 的硫酸铵原液 混合直至试管中出现沉淀为止 记录加入的硫酸 铵的量 再加入适量的水 使体系变得澄清 记录所加入的水 并继续加入硫 酸铵使系统再次变混浊 如此反复操作 计算达到混浊时 PEG 与硫酸铵在体系 中所占的质量百分数 以硫酸铵的质量分数为横坐标 以 PEG 浓度为纵座标即 可得到相图的双节点曲线 表面活性剂双水相体系相图的制作方法 分别配制浓度为 0 05mol L 的 CTAB 和 SDS 溶液计算其质量分数 做为 纯组分 分别占据三元相图的两个顶点 以水作为另一个顶点 在三元相图上 均匀的取点 按规定浓度混合配制样品在一定温度下恒温一段时间 具体时间 待定 观察其分相情况 记录分相时间及组成 绘制三元相图 2 粗酶液的制备 按上述配方配制假单胞菌发酵培养基 100ml 分装到 2 个 250ml 锥心瓶中 灭菌后向每瓶中分别接种 1ml 活化后的假单胞菌种 置于 28 左右的摇床中培 养 60h 将所得溶液在 4000r min 条件下离心 10min 取上层清液即为所需的粗 酶液 3 双水相萃取脂肪酶 PEG NH4 2SO4双水相体系 先将 PEG1000 和 NH4 2SO4分别配制成质量分数为 50 和 40 两种浓度 然后按照一定的比例混合 保证体系中的 PEG1000 质量分数分别为 15 20 25 NH4 2SO4质量分数分别为 15 20 25 的浓度 即 有 9 组不同的体系进行实验 取上述 9 种体系 8g 置于 10ml 刻度试管中 向其 中加入 2g 粗酶液 静置 15min 左右 观察分相情况并记录上下相体积比 分别 取出上下相溶液留待后面实验使用 SDS CTAB 双水相体系 分别配制 0 05mol L 的 CTAB 和 SDS 溶液 并按 1 5 1 1 75 1 1 1 1 1 75 1 1 5 等浓度比混合 使其形成 5 种不同的 双水相体系 在不同的水浴温度下进行实验 研究温度以及体系配比对于表面 活性剂双水相体系萃取效果的影响 4 蛋白质含量测定 本实验采用的蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法 先用标准牛血清蛋白 制作标准曲线 用分光光度计检测 595nm 处的吸光度 并对照标准曲线即可得 到体系中蛋白质含量 若测得吸光度值过高可稀释后再测 5 酶活检测 滴定法测酶活 向 50ml 锥形瓶中加入 5mlTris HCl PH8 5 4ml 橄榄油乳化液在 45 水浴 锅中预热 4 5min 加入脂肪酶液 1ml 在 45 水浴锅中反应 10min 反应完后 立即用 15min 中止液 乙醇 丙酮 1 1 混合液 中止反应 向反应后溶液中加 入酚酞指示剂 用 0 05mol LNaOH 进行滴定 对照组为加入脂肪酶液后不反应 而立即中止 酶活的定义为单位时间内所产生脂肪酶的量 计算公式为 实验 组 对照组 10 pNPP 法测酶活 取 4mlpNPP 底物置于 45 水浴锅中预热 5min 加入 50 l 稀释后的酶液 在 45 下反应 5min 后 加入 10 l 的 0 05mol L EDTA 溶液后立即放入冰水 中中止反应 用紫外可见分光光度计测定 405nm 波长处的吸光度 根据所产 生的对硝基苯酚 pNP 浓度来计算酶活 单位酶活定义为 45 下 PH8 5 时 每分钟分解 pNPP 并释放 1 l 对硝基苯酚所需酶量 6 PEG 沉淀 取双水相体系中的上相溶液 PEG 相 脂肪酶主要分布于上相 分别向 其中加入 PEG 使体系中 PEG 质量分数分别为 20 30 40 50 60 等 室温下静置 10h 以上 8000r min 离心 收集沉淀并溶于蒸馏水中 留待层析时 使用 7 分子筛层析纯化脂肪酶 层析方法参考课件 所使用的凝胶为实验室中用于纯化脂肪酶的葡聚糖凝胶 四 实验结果及讨论 1 双水相相图 PEG NH4 2SO4双水相体系 实验中加入 NH4 2SO4以及水的量如下表 初始加入 PEG 量为 5ml NH4 2SO4 m 650190220260260 H2O m400400400400200 NH4 2SO4 m 140160140160140 H2O m200200180200180 NH4 2SO4 m 140140130 5100120 H2O m180150150150100 NH4 2SO4 m 40110 510010065 H2O m100100100100100 NH4 2SO4 m 8080959095 H2O m100100100100 所得的相图如下 PEG NH4 2SO4 相图 0 5 10 15 20 25 30 35 40 4789910101011 NH4 2SO4 PEG SDS CTAB 双水相相图 该相图为三角形相图 引用自文献 12 在实验中我们发现在室温下基本 无法分相 而且很多都凝成了固体装物质 无法摇动 在 45 水浴下也只有 3 号有分相现象 即上图中的左边 1 区域 而右边的双水相区则没有看到 而且 该体系分相所需的时间也比较长 所以在后面的实验中并没有使用该体系 2 双水相萃取 PEG NH4 2SO4体系 配制的双水相体系如下表 12345678 PEG15 15 15 20 20 20 25 25 NH4 2SO415 20 25 15 20 25 15 20 分相后所的到的体系中 上下相比例如下 其中 1 号未分相 可能是由于浓度 太低 2345678 上相 ml 6 26 65 64 442 83 2 下相 ml 2 82 63 24 655 85 6 3 蛋白质含量测定 标准曲线制作 所得到的标准曲线如下图 试管编号0123456 100ug ml 标准蛋白 ml 0 00 10 20 30 40 50 6 0 15mol L NaCl ml 10 90 80 70 60 50 4 考马斯亮蓝试剂 ml 5555555 摇匀 1h 内以 1 号管为空白对照 在 595nm 处比色 A595nm00 09670 16470 2430 30930 41430 4873 蛋白质标准曲线 y 0 008x 0 0049 R2 0 9972 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 010203040506070 蛋白质含量 ug 吸光度 595nm A 实验中 测得的各组的上 下相体系蛋白质含量测定值对照标准曲线为 所检测的样品量为 1ml 编号2 上2 下3 上3 下4 上4 下5 上 吸光度 0 5730 4180 5560 3890 5150 5480 404 蛋白质含量 ug 8 0926 1577 8805 7957 3687 7805 982 编号5 下6 上6 下7 上7 下8 上8 下 吸光度 0 550 5250 6770 5960 5140 7720 72 蛋白质含量 ug 7 8057 4939 3908 3797 35510 5769 927 4 酶活测定 实验中用滴定法测酶活由于滴定终点不好判断 测得的酶活不够准确 而 且测定过程较复杂 所以后来改用 pNPP 法进行测定 实验标准曲线如下 y 17 137x 0 0141 R2 0 9967 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 1 6 1 8 2 00 020 040 060 080 10 12 pNP浓度 mM OD405 实验所测得的数据对照标准曲线可得各管内的上下相酶活 实验编号2 上2 下3 上3 下4 上4 下5 上 吸光度 405nm 1 0591 0381 051 0261 0661 0821 003 酶活 12 52312 27812 41812 13812 60512 79211 870 实验编号5 下6 上6 下7 上7 下8 上8 下 吸光度 405nm 1 1061 0881 1331 0360 4351 2190 416 酶活 13 07212 86213 38712 2555 24114 3915 019 综合上述数据可得下列表格 其中所反应的为体系中总的蛋白质含量及酶活 实验编号体积比总蛋白质含量总酶活 2 上 6 225 086441552 9512 2 下 2 88 62022687 6072 3 上 6 626 004331639 2684 3 下 2 67 53389631 2124 4 上 5 620 631241411 816 4 下 3 212 44848818 7008 5 上 4 413 16151044 5776 5 下 4 617 951961202 6516 6 上 414 98621028 976 6 下 523 4771338 74 7 上 4 920 5297751201 0292 7 下 5 821 33182607 9908 8 上 4 624 326641323 9812 8 下 5 426 80452542 106 由上表数据可以看出 2 号和 3 号中两相的分配系数差别最大 所以萃取 脂肪酶的最适条件为 PEG 15 NH4 2SO4 20 25 由于时间原因 后面的实验 PEG 沉淀还没有完成 层析也没有做 只有初 步的实验方案 5 实验总结 在本次的生计大实验中 我们都学到了很多以前都没有学到过的东西 首 先就是实验的设计以及对于实验的总体把握 与以前的实验不同的是 本次实 验基本都是我们自己设计并安排的 而以前的实验教学我们则是按照老师所给 的现成实验方案来做 虽然也能学到一写实验基本技术 但却无法从总体上了 解一种问题的研究方法 实验中 我们从最初的查找资料到设计实验 对于双水相这种技术也有了 越来越明确的概念 同时也对于其中所应用到的各种技术有了更加深入的了解 比如测定酶活及蛋白质含量 以前虽然也做过 但都是单纯的测定 与这次的 实际问题的应用中是完全不一样的 其中还要考虑到很多其它的因素 这次的生计大实验教会了我们在实际问题的研究中的一些基本的过程及方 法 虽然这次的实验由于时间关系没有完成 而且在实验过程中也经历了几次 的失败 但是每次的失败对于我们来说都是一次锻炼和学习的机会 让我们知 道了在这类问题的研究中应该注意的一些问题 从而避免在以后的学习及研究 中再