水中大肠杆菌的检测方法

word 完美格式 精心整理 学习帮手 附件 水中大肠杆菌群检测方法 多管发酵法水中大肠杆菌群检测方法 多管发酵法 NIEA E201 54B 一 方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性 不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌 且能在 35 1 48 3 小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群 Coliform group 在不同体积或不同稀释度 之水样所产生之结果 以 100 mL 水中最大可能数 MPN 100 mL 表示 100 mL 水中存在之大肠杆菌 群数目 二 适用范围 本方法适用地面水体 地下水体 废水 污水及水源水质水样中大肠杆菌群之检验 三 干扰 一 水样中含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长之物质 二 检测使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌群细菌生长的物质 四 设备 一 量筒 100 至 1000 mL 之量筒 二 吸管 有 0 1 刻度之 10 mL 灭菌玻璃吸管或市售无菌塑料吸管 或无菌微量吸管 micropipet 三 试管 大小约 150 15 mm 之试管或有盖螺旋试管 四 发酵管 fermentation tube 大小约 22 9 mm 之玻璃管 五 稀释瓶 容量约 100 mL 可灭菌之硼硅玻璃制品 六 锥形瓶 200 至 2000 mL 之可灭菌硼硅玻璃制品 七 采样容器 容量 120 mL 以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器 或市售无菌袋 八 冰箱 温度能保持在 4 2 者 九 天平 待测物重量大于 2 g 时 须能精秤至 0 01 g 待测物重量不大于 2 g 时 须能精秤至 0 001 g word 完美格式 精心整理 学习帮手 十 培养箱 温度能保持在 35 1 者 十一 高压灭菌釜 温度能维持在 121 压力约 15 lb in2 或 1 1 Kg cm2 灭菌 15 分钟以上者 十二 高温干热烘箱 如用于玻璃器皿等用具之灭菌 温度须能保持在 160 达 2 小时或 170 达 1 小时以上 者 十三 接种环 为白金或镍铬合金制 适用于细菌接种或移植 亦可使用无菌塑料制品 十四 pH 计 精确度达 0 1 pH 单位 五 试剂 一 试剂水 蒸馏水或去离子水 导电度在 25 时小于 2 mho cm S cm 二 培养基 应使用市售商品化培养基 硫酸月桂酸胰化蛋白胨培养基 Lauryl sulfate tryptose broth 简称 LST 1 倍浓度 LST 培养基含有下列成份 胰化蛋白胨 Tryptose 20 0g 乳糖 Lactose 5 0g 氯化钠 NaCl 5 0g 磷酸氢二钾 K2HPO4 2 75g 磷酸二氢钾 KH2PO4 2 75g 硫酸月桂酸钠 Sodium lauryl sulfate 0 1g 试剂水 1L 配成 2 倍浓度 取 71 2 g LST 培养基粉末溶于 1 L 试剂水 完全溶解后 分取 10 mL 注入装 有倒置发酵管之试管内 经 121 灭菌 15 分钟 冷却后备用 灭菌后培养基之 pH 值应在 6 8 0 2 灭菌后培养基若未当日使用 应保存在 4 2 保存期限为 14 天 可根据检验需求量 依 配方配制培养基 煌绿乳糖胆汁培养基 Brilliant green lactose bile broth 简称 BGLB word 完美格式 精心整理 学习帮手 1 公升的 BGLB 培养基中含有下列成份 蛋白胨 Peptone 10 0g 乳糖 Lactose 10 0g 牛胆粉 Oxgall Powder 20 0g 煌绿色试剂 Brilliant Green 0 0133g 试剂水 1L 取 40 g BGLB 培养基粉末溶于 1 L 试剂水 完全溶解后 分取 5 至 10 mL 注入装有倒置发酵管 之试管内 经 121 灭菌 15 分钟 冷却后备用 其 pH 值应在 7 2 0 2 灭菌后培养基若未当日 使用 应保存在 4 2 保存期限为 14 天 可根据检验需求量 依配方配制培养基 三 无菌稀释液 磷酸二氢钾储备溶液 取 3 4 g 磷酸二氢钾 KH2PO4 溶于 50 mL 的试剂水中 俟完全溶解后 以 1 0 N NaOH 溶液调 节其 pH 值为 7 2 0 1 然后加试剂水至 100 mL 灭菌 过滤灭菌或 121 高温高压灭菌 15 分钟 后储存于冰箱中备用 4 2 下保存期限为 3 个月 氯化镁储备溶液 取 8 1 g 氯化镁 MgCl2 6H2O 先溶于少量试剂水 俟完全溶解后 再加试剂水至全量为 100 mL 灭菌 过滤灭菌或 121 高温高压灭菌 15 分钟 后 储存于冰箱中备用 4 2 下保存期限 为 3 个月 无菌稀释液 分别取 10 mL 氯化镁储备溶液和 2 5 mL 磷酸二氢钾储备溶液再加入试剂水至 2 000 mL 混摇均 匀后 分装于稀释瓶中 经 121 灭菌 15 分钟 作为无菌稀释液备用 如欲用于水样稀释 分装之 无菌稀释液灭菌后体积须为 90 2 0 mL 4 2 下保存期限为 3 个月 六 采样与保存 一 盛装水样检验微生物之容器 应使用清洁并经灭菌之玻璃瓶或无菌塑料容器或市售无菌采样袋 且 于采样时应避免受到污染 水样若含有余氯时 无菌容器中应加入适量之无菌硫代硫酸钠 采取加氯之 word 完美格式 精心整理 学习帮手 废水时 每 100 mL 水样中加入 0 1 mL 10 硫代硫酸钠可还原 15 mg L 余氯 采取含氯之饮用水水样 时 每 100 mL 之水样如加入 0 1 mL 之 3 硫代硫酸钠 可中和之余氯量约为 5 mg L 二 采样前应清洁手部 再行采水样 所采水样应具有代表性 三 运送时水样温度应维持在小于 10 且不得冻结 而实验室内保存温度应维持在 4 2 四 水样应于采样后 24 小时内完成推定实验之水样添加步骤 七 步骤 一 并置入培养箱中培养 五 水样量须以能做完所需检验为度 但不得少于 120 mL 七 步骤 试验分两阶段进行 首先进行推定试验 若推定试验结果为阳性反应 则继续进行第二阶段之确定 试验 如结果仍是阳性反应则显示有大肠杆菌群存在 各试验步骤如下述 一 推定试验 慎选发酵管中没有气泡且未污染之 10 mL 2 倍浓度 LST 试管 水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃 25 次以上 以使样品充分混摇均匀 视水样中微生物可能浓度范围进行水样稀释步骤 使用无菌吸管吸取 10 mL 水样至 90 mL 无菌稀释 液中 形成 10 倍稀释度水样 混合均匀 而后自 10 倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列适当 之 100 1000 10000 倍等稀释水样 进行稀释步骤时 均需更换无菌稀释吸管 水样稀释步骤如图 一所示 注 1 以无菌吸管分别取各稀释度 10 mL 水样至内含 10 mL 2 倍浓度的 LST 试管中 每一稀释度各作 5 支 小心混合均匀 混合后发酵管内不可产生气泡 在 35 1 培养箱中培养 48 3 小时 观察并记录发酵情形 若有气体产生则推定试验为阳性反 应 若无气体产生则推定试验为阴性反应 但若培养液呈混浊状态 虽无产气 亦应进行确定试验 二 确定试验 若推定试验之发酵管中有气体或混浊产生时 则使用 BGLB 进行确定试验 慎选发酵管中没有气泡且未污染之 BGLB 试管 利用无菌接种环自产生气体以及混浊之 LST 培养基试管中 接种一圈培养液至 BGLB 培养基试管中 在 35 1 培养箱中培养 48 3 小时 word 完美格式 精心整理 学习帮手 在 48 3 小时内 BGLB 培养基试管如有气体产生 则确定试验为阳性反应 八 结果处理 一 经确定试验确认 BGLB 试管为阳性反应后 应以 100 mL 水中最大可能数 MPN 100 mL 计算及记录 5 支发酵管连续三种稀释度之 MPN 可查表一 二 表一所示接种之水样量为 10 mL 1 0 mL 及 0 1 mL 若所用之稀释度有三种以上时 采用最具意义之 三种稀释度 查表后再计算 100 mL 水中大肠杆菌群最大可能数 稀释度之选取方式如下 先选取 5 管均呈阳性反应的最高稀释度 此时稀释度较低之各组试管必须全部呈阳性反应 再选 取下两个稀释度 如表二水样别 a 如果稀释度最低的一组并非 5 管均呈阳性反应 则选取稀释度最低的一组 再选取下两个稀释度 如表二水样别 b c 如果依据上述原则 及 选取 3 个稀释度后 下一稀释度试管组仍有阳性反应试管 则舍 弃原先 3 组中稀释度最低的一组 纳入下一稀释度的数据 如表二水样别 d 如果依据上述原则 至 选取 3 个稀释度后 更高稀释度之试管组仍有阳性反应试管 则 把更高稀释度之阳性反应试管数加至原先 3 组中稀释度最高的一组 如表二水样别 e 三 100 mL 水中大肠杆菌群最大可能数 MPN 100 mL 之计算公式如下 结果小于 100 时 以整数表示 小数字数四舍五入 菌落数大于 100 以上时 只取两位有效数 字 例如 110 以 1 1 102表示 16 000 以 1 6 104表示 四 检测纪录须注明采样时间 培养起始及终了时间 培养基名称 培养温度及各稀释度的数据等相关数 据 九 质量管理 一 微生物采样人员及检测人员应具备微生物基本训练及知识 二 每批次采样时应进行运送空白 三 每批次或每 10 个水样需进行试剂空白实验 四 新购入之培养基 每批号均须以大肠杆菌群阳性控制菌株 如E coli Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii 进行测试 以确保数据质量 word 完美格式 精心整理 学习帮手 五 若一季期间水样均未检出大肠杆菌群 则须以大肠杆菌群菌株进行培养基测试 以确保数据质量 六 本方法培养所得之细菌可能具有感染性 检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理 十 精密度及准确度 略 十一 参考数据 一 APHA 2005 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 21st Edition Section 9221 American Public Health Association Washington D C 二 Difco BBL Manual Manual of Microbiological Culture Media 2003 BD Diagnostic Systems 注 1 水样如须稀释 建议于稀释后 30 分钟内完成检测步骤 以免造成细菌死亡或增生 影响实验结果 word 完美格式 精心整理 学习帮手 图一图一 水样稀释步骤水样稀释步骤 表一表一 三连续稀释度 三连续稀释度 1010 mLmL 1 1 mLmL 0 10 1 mLmL 五试管重复测试时 阳性结果组合之 五试管重复测试时 阳性结果组合之 MPNMPN 指数及指数及 95 95 信赖区间信赖区间 95 信赖区间 95 信赖区间 阳性反应组合 MPN 100 mL 下限 上限 阳性反应组合 MP