土壤中细菌总数的测定

精品文档 1欢迎下载 土壤中细菌总数的测定 摘要摘要 土壤微生物是指生活在土壤中的细菌 真菌 放线菌 藻类的总称 其 个体微小 一般以微米或毫微米来计算 通常 1 克土壤中有 106 109个 其种 类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化 它们在土壤中进行氧化 硝 化 氨化 固氮 硫化等过程 促进土壤有机质的分解和养分的转化 关键词关键词 土壤 细菌 培养 灭菌 革兰氏染色 前言前言 土壤微生物可以形成土壤结构 土壤并不是单纯的土壤颗粒和化肥的简 单结合 作为土壤的活跃组成分 土壤微生物在自己的生活过程中 通过代谢 活动的氧气和二氧化碳的交换 以及分泌的有机酸等有助于土壤粒子形成大的 团粒结构 最终形成真正意义上的土壤 土壤微生物的区系组成 生物量及其 生命活动对土壤的形成和发育有密切关系 在植物根系周围生活的土壤微生物 还可以调节植物生长 植物共生的微生物如根瘤菌 菌根和真菌等能为植物直 接提供氮素 磷素和其他矿质元素的营养以及有机酸 氨基酸 维生素 生长 素等各种有机营养 促进植物的生长 土壤微生物与植物根部营养有密切关系 所以 测定土壤中微生物的总数对农业活动及人类生活有重大意义 一 实验目的 1 掌握从环境土壤微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术 2 掌握无菌操作技术 3 掌握革兰氏染色技术 2 实验原理 土壤中细菌总数的测定采用平板培养菌落计数法 土壤细菌的培 养基通常选择肉膏蛋白胨培养基 细菌在恒温箱培养 24 小时后长成菌落 进行 计数 并对菌落菌种进行鉴定和革兰氏染色 3 实验材料及器具 土样 肉膏蛋白胨培养基 天平 移液管 6 支 锥形瓶 2 个 试管 10 支 量筒 培养皿 6 个 烧杯 高压蒸汽灭菌锅 蒸馏水等 4 实验步骤 1 取样 从肥沃 湿润的土壤中取样 先铲去表层 3cm 左右 在取样 装 入事先灭菌的烧杯中 2 培养基的配制 称量及溶化 分别称取蛋白胨和 Nacl 的所需量置于烧杯中 加入所需水 量的三分之二左右的蒸馏水 用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一烧杯中进行称量 然后加入少量蒸馏水溶化 倒入第一个烧杯中 精品文档 2欢迎下载 调节 pH 用 1mol L 的 Hcl 调节至 7 2 左右 定容 将溶液倒入量筒中进行补充水量到所需体积 加入所需的琼脂到锥形瓶中 用报纸将锥形瓶包扎好放入高压蒸汽灭菌锅 0 1MPa 120 进行灭 菌 20min 3 将已经准备好的玻璃仪器进行洗涤 洗涤干净后进行干燥 干燥完成后将玻 璃仪器用报纸包扎好放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌 灭菌后取出干燥 4 制备土壤稀释液 取 9 0ml 无菌水试管 6 支 按 10 2 10 7顺序编号 放置试管架上 取 无菌移液管一支 从移液管包装纸套中间撕口 将包装纸套分成上 下两段 去除上段包装纸套 在移液管上端管口装橡皮头 取出下段移液管纸套放置桌 面 以右手拇指 食指 中指拿住移液管上端的橡皮头 将吸液端口及移液管 外部表面迅速通过火焰 2 3 次 杀灭撕纸套时可能污染的杂菌 切忌用手指去 触摸移液管吸液端口及外部 左手持锥形瓶底 以右手掌及小指 无名指夹住 锥形瓶上棉塞 在火焰旁拔出棉塞 棉塞夹在手上 不能乱放在桌上 将 1ml 移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶中土壤悬液底部 用手指轻按橡皮头 在锥形瓶内反复吹吸三次 吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面 然后准确吸取 1ml10 2土壤稀释液 右手将棉塞插回锥形瓶上 左手放下锥形瓶 换持一支盛有 9 0ml 无菌水试管 依前法在火焰旁拔除试管帽 或棉塞 将 1ml10 2土壤稀释液注入 9 0ml 无菌水试管内 制成 10 3的土壤稀释液 将此移 液管在试管内反复吹吸三次 然后取出移液管 并将其通过火焰再插入原来包 装移液管的下段纸套内 以备再用 盖上试管帽 右手持 10 3稀释液试管在左 手上敲打 20 30 次 混匀土壤稀释液 再从纸套中取出原来的移液管 插入稀 释液已混匀的试管内 再吹吸三次 然后准确吸出 1ml10 3稀释液 置第二支装 有 9 0ml 无菌水试管中 制成 10 4的土壤稀释液 用同法再制成 10 5 10 6 10 7的土壤稀释液 为避免稀释过程误差 进行微生物计数时 最好每一个 稀释度更换一支移液管 5 倾注 按无菌操作法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至 45 50 的 3 种培 养基 待冷凝后 用无菌移液管 或无菌微量移液器 分别吸取上述 10 7 10 6 10 5三个稀释度菌悬液 0 1ml 依次滴加于相应编号已制备好的肉膏蛋白胨培 养基平板上 按照浓度从低到高的顺序涂布平板 右手持无菌玻璃涂棒 左手拿 培养皿 并用拇指将皿盖打开一缝 在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面 将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散 切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘 或将培养基划破 精品文档 3欢迎下载 6 培养 待平板上稀释悬液完全吸收后 将平板倒置于 30 恒温箱中培养 24h 7 菌落的计数 当平板上有链状菌落生长时 如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限 则 应作为一个菌落计 如存在有几条不同来源的链 则每条链均应按一个菌落计 算 不要把链上生长的每一个菌落分开计数 如有片状菌落生长 该平板一般 不宜采用 如片状菌落不到平板一半 而另一半又分布均匀 则可以半个平板 的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数 当计数平板内的菌落数过多 即所有稀释 度均大于 300 时 但分布很均匀 可取平板的一半或 1 4 计数 再乘以相应稀 释倍数作为该平板的菌落数 计数原则 选平均菌落数在 30 300 之间者进行 计算 仅 1 个稀释度的平均菌落数在此范围时 则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之 若有 2 个稀释度的平均菌落数在 30 300 之间时 则按两者的菌落总数之比来 决定 若比值小于 2 应报告两者的平均数 若大于 2 则报告其中较小的菌落总 数 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300 以稀释度最高的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30 则应按稀释度最低的平均菌落数乘以 稀释倍数报告之 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30 300 之间 则以最接近 300 或 30 的平 均菌落数乘以稀释倍数报告之 若所有的菌落数匀为 无法计数 时 应注明水样的最大稀释倍数 在求同稀释度的平均数时 若其中 1 个平板上有较大片状菌落生长时 则不 宜 采用 而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数 若片状菌 落约 为平板的一半 而另一半平板上菌落分布很均匀 则可按半平板上的菌落 计数然后乘以 2 作为整个平板的菌落数 8 革兰氏染色 将所培养出来的菌种进行革兰氏染色 判断其中的菌种是阳性 还是阴性 精品文档 4欢迎下载 5 实验结果记录 稀释度 10 510 610 7 平板 aa bb c c 菌落数 平均菌落数 菌落总数的计算 方法 1g 土壤中细菌总 数 六 实验结论