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医学生物化学实验教案第 1 次课 2学时实验项目 3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖 实验性质设计性实验教学目的和要求1、了解糖的还原性2、掌握还原糖定量测定的原理和方法。3、熟悉分光光度计的使用方法。教学重点与难点重点:绘制标准曲线的方法，分光光度计的使用原理和使用方法。难点：标准曲线的应用。实验材料1.试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为1.0mg/mL。（2）3，5-二硝基水杨酸试剂：称取6.3 g 3，5-二硝基水杨酸并量取262 mL 2mol/L NaOH加到酒石酸钾纳的热溶液中（182 g酒石酸钾纳溶于500 mL水中），再加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000 mL贮于棕色瓶中。（3）未知浓度还原糖。2. 材料 小麦淀粉或玉米淀粉。3. 器材 分光光度计，天平，水浴锅，电炉，试管若干等。实验内容一、实验原理：在NaOH和丙三醇存在下，3，5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。黄色 桔红色二、实验步骤：1.取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/ml葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL)DNS(mL)葡萄糖含量(mg)光密度值(OD-540nm)100.50.5020.10.40.50.130.20.30.50.240.30.20.50.350.40.10.50.460.500.50.57（未知浓度还原糖）0.500.50.5将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸馏水补足至5mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用1号管调零点，分别测出26号管的光密度值。2.绘制标曲以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线（电脑Excel完成最好）。计算7号管还原糖的百分含量。三、结果与计算：计算出7号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 查曲线所得葡萄糖毫克数提取液总体积/测定时取用体积还原糖(%) =100% 样品毫克数教学过程中师生活动设计 糖的还原性，具有还原性的糖结构有何特点？提纲、板书设计 实验原理及反应方程式，实验步骤中表1及计算公式作业 1、 为什么要设置空白对照？2、 标准曲线的定义？主要参考资料1 生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，2010总结分析1、 让学生理解糖定量测定的原理及方法；2、 强调标准曲线的绘制要点；3、 需要和学生一起推导还原糖浓度的公式 医学生物化学实验教案第 2次课 2学时实验项目 糖的呈色反应和还原糖检验实验性质验证性实验教学目的和要求1.了解糖类某些颜色反应的原理2.学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法教学重 点与难点重点：颜色反应鉴别糖的方法难点：鉴别糖的反应原理实验材料1、仪器：试管及试管架、滴管、移液管及恒温水浴锅2、试剂：莫氏试剂、塞氏试剂、托伦试剂；1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、1%果糖溶液、1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液实验内容一、实验原理：萘酚反应：糖在浓无机盐作用下，脱水生成糠醛衍生物，后者在浓硫酸的作用下能与萘酚生成紫红色物质，在糖液面与浓硫酸液面间出现紫色环。但一些非糖物质对此反应也呈阳性间苯二酚反应：在酸作用下，酮糖脱水生成羟甲基醛，后者可与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮糖的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应慢。托伦反应：戊糖在浓酸作用下脱水生成糠醛，后者可与间苯三酚结合生成樱桃红色物质。本反应常用来鉴定戊糖，戊糖此反应最快，可以和其他糖类区分。二、操作步骤： 萘酚反应：先取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液、1%蔗糖溶液，然后向3支试管中各加入2滴莫氏试剂，混匀。另外取1支试管，只加2滴莫氏试剂作为空白对照，倾斜4支试管，沿各试管壁缓慢加入浓硫酸约1.5 mL，慢慢立起试管 ，切勿摇动。试管 中液体分成两层，浓硫酸在试液下面。在两液分界处有紫红色环出现。观察、记录各管颜色。间苯二酚反应：取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液各0.5 mL。再向各管分别加入塞氏试剂2.5 mL，混匀。将3支试管同时置于沸水浴中，注意观察颜色的变化及变化时间。托伦反应：取3支试管，分别加入1%阿拉伯糖溶液、1%半乳糖溶液、1%葡萄糖溶液各0.1 mL，再向各管分别加入托伦试剂1 mL，混匀。将3支试管同时置于沸水浴中，观察、记录颜色的变化及颜变化的时间。教学过程中师生活动设计观察和记录各管颜色及颜色变化的时间后，说出各管颜色变化的原因。提纲、板书设计原理及操作步骤作业1.简述萘酚反应原理。2.可用何种颜色反应鉴别酮糖存在。主要参考资料1 生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，2010总结分析1、让学生掌握糖显色反应的原理；2、给学生强调注意观察各管颜色变化的时间医学生物化学实验教案第 3次课 2学时实验项目 蛋白质等电点和沉淀反应实验性质基础性实验 教学目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。2.学习测定蛋白质等电点的方法。3.了解蛋白质变性与沉淀的关系及沉淀蛋白质的方法以及其实用意义。教学重点与难点重点：学习测定蛋白质等电点的方法及沉淀蛋白质的方法。难点：蛋白质变性与沉淀的关系，沉淀的蛋白质不一定表现为变性；变性的蛋白质不一定表现为沉淀。实验材料（一）材料新鲜鸡蛋（二）试剂1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL2、1.00mol/L醋酸溶液100mL3、0.10mol/L醋酸溶液300mL4、0.01mol/L醋酸溶液50mL5、蛋白质溶液500mL 5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清:水=1:9）6、pH4.7醋酸醋酸钠的缓冲溶液100mL7、3%硝酸银溶液10mL8、5%三氯乙酸溶液50mL9、95%乙醇250mL10、饱和硫酸铵溶液250mL11、硫酸铵结晶粉末10000mL12、0.1mol/L盐酸溶液300mL13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL14、0.05mol/L碳酸钠溶液300mL15、甲基红溶液20mL（三）器具水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管架 实验内容1.实验原理：蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。蛋白质的沉淀反应可分为两类。（1） 可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。（2） 不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固。蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。二、实验步骤：（一）酪蛋白等电点的测定（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。试管号蒸馏水（mL）0.01 mol/L蜡酸（mL）0.1 mol/L蜡酸(mL)1.0 mol/L蜡酸(mL)18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6 （2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。（二）蛋白质的沉淀及变性1、蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。此时析出沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。2、重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？3、 某些有机酸沉淀蛋白质 取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。4、有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl，混匀。5、 乙醇引起的变性与沉淀 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 试剂（mL）管号蛋白质溶液0.1mol/L氢氧化钠溶液0.1mol/L盐酸溶液95%乙醇pH4.7缓冲溶液123111111111 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻向各管内加入水8mL，然后在第2，3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。教学过程中师生活动设计 蛋白质沉淀原理，什么是蛋白质变性？根据性质推测其应用提纲、板书设计 原理及简要操作步骤作业 1.什么是等电点？2.临床上为什么可以用蛋清或牛乳解救误服金属盐的病人？主要参考资料1 生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010总结分析1、 通过原理分析，帮助学生理解“沉淀的蛋白质不一定表现为变性；变性的蛋白质不一定表现为沉淀”；2、 重点区别：“可逆沉淀”与“不可逆沉淀”医学生物化学实验教案 第 4 次课 2学时实验项目 蛋白质和氨基酸显色反应 实验性质基础性实验 教学目的和要求1.学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。2.了解蛋白质与氨基酸的显色反应原理。教学重 点与难点重点：蛋白质与氨基酸的显色反应原理。难点：鉴定蛋白质与氨基酸的方法。实验材料试剂：0.5%醋酸铅1mL、10%NaOH、1%CuSO4器具：水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL容量瓶、吸管、试管及试管架 实验内容一、实验原理：1.双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。2.苯环的黄色反应 Tyr（Trp）+浓硝酸黄色 Phe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 3.醋酸铅反应（半胱氨酸和胱氨酸） R-SH+2NaOHR-OH+Na2S+H2ONa2S +Pb2+PbS+2Na+PbS+2HCl PbCl2+H2S二、实验步骤：1.双缩脲反应(biuret reaction) 取1支试管，加乳蛋白溶液（蛋清:水=1:9）约1mL和10%NaOH约2mL，摇匀，再加1%CuSO4溶液2滴，随加随摇。观察现象，记录。2.苯环的黄色反应 向6个试管中按下表加试剂，观察现象并记录。鸡蛋清溶液（蛋清:水=1:9）管号123456材料鸡蛋清液指甲头发0.5%苯酚0.3%色氨酸0.3%酪氨酸（滴）4少许少许444浓硝酸（滴）22020444现象逐滴加10% NaOH后现象变化3.醋酸铅反应0.5%醋酸铅1mL、10%NaOH1mL、卵清蛋白1mL三样试剂混匀加热，观察现象。然后冷却至2030，加10滴浓HCL，再将湿润的醋酸铅试纸放于管口，加热，嗅其气味同时观察试纸颜色变化。教学过程中师生活动设计 含苯环的氨基酸有哪些？双缩脲反应颜色与什么相关？提纲、板书设计 原理及简要操作步骤作业 1.在实验室如何区分核酸和蛋白质？2.黄色反应中为何会出现深浅不一的黄色？主要参考资料1生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010总结分析1、 实验过程中让学生重点观察颜色变化的过程；2、 醋酸铅反应的每一步都要记录现象医学生物化学实验教案 第 5次课 2学时实验项目 糖的薄层层析 实验性质基础性实验 教学目的和要求1.了解薄层层析的基本原理。2.熟悉薄层层析的操作过程。教学重 点与难点重点：掌握薄层层析的吸附原理。难点：掌握分配系数，Rf值。实验材料四种糖样品、染色液、扩展剂、层析缸、层析板等实验内容一、实验原理：薄层层析(简称TLC)是在吸附层析基础上发展起来的一种微量而快速的层析法，它是在吸附剂或支持剂均匀涂布的薄层上进行的，故称薄层层析。为了使所要分析的样品各组分得到分离，必须选择合适的吸附剂。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，在吸附剂或支持剂中添加合适的粘合剂后再涂布，可使薄层紧贴在玻璃板上。糖是多羟基化合物在硅胶G薄层上展层时，被吸附的强弱有差异，同时在展开剂中溶解性质也有差异。吸附力主要与糖的相对分子质量和羟基数有关，一般为三糖二糖单糖，醛糖酮糖脱氧糖。经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖己糖双糖三糖。薄层层析与其他方法比有明显的优点：层析时间短、样品用量范围大(1g-0.5g)、观察结果方便、可以分离多种化合物等，其灵敏度比纸层析高10-100倍，显色方法甚至可以用腐蚀性显色剂。而且薄层层析法操作方便，设备简单，所以薄层层析法目前应用范围相当广泛。二、实验步骤：1点样 选取制备好的薄板一块，在距底边1.5cm 的直线上均匀选4个点。用毛细管分别点上不同的糖样品于4个点，样品量控制在5-10g，斑点直径不超过3mm。点样完毕，立即用电热吹风机吹干样点。2展层 将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1cm 处时取出薄板，在溶剂前沿处作一记号，于80下烘干5min。3显色 除尽溶剂后，向薄层板上喷雾糖显色剂，于80下烘干10min，则各种糖分别显出不同的颜色。三、实验结果：（1）记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值。（2）鉴定混合糖中糖的种类，并绘出层析图谱。教学过程中师生活动设计 还有哪些层板方法？提纲、板书设计 原理及简要操作步骤作业 何谓Rf值？Rf值与什么因素有关？主要参考资料1生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，20102生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010总结分析1、 点样是本实验的关键，教师在指导学生操作时，强调点样要轻、快，稳、小并且点样点要集中；2、 放展板时，点样点不要浸如展层溶液中医学生物化学实验教案 第 6次课 2学时实验项目 酶的特性 实验性质基础性实验 教学目的和要求掌握酶促反应速度的几个主要影响因素了解淀粉水解程度的鉴定。教学重 点与难点重点：唾液淀粉酶催化的酶促反应；淀粉水解程度的判断。难点：酶活性的影响因素。实验材料仪器：水浴锅、电炉、白瓷板、试管、量筒、漏斗、脱脂棉。试剂：0.2%、0.5%淀粉液、0.3%NaCl、0.85%NaCl溶液、1%CuSO4溶液、1%Na2SO4、pH=5.0、pH=8.0、pH=6.8缓冲溶液。实验内容一、实验原理：温度与酶促反应速度关系密切。温度降低时，酶促反应速度降低以至完全停止；随着温度升高，反应速度逐渐加快。在某一温度时反应速度达到最大值，此温度称酶作用的最适温度。温度继续升高，反应速度反而下降。人体内大多数酶的最适温度在37左右。 pH值也会影响酶促反应速度。因为酶本身是蛋白质，pH不仅影响酶蛋白分子某些基团的解离，也影响底物的解离程度，从而影响酶与底物的结合。当酶促反应速度达到最大值时的溶液pH值，称为该酶的最适pH。不同的酶最适pH值不尽相同，人体多数酶的最适pH值在7.0左右。例如唾液淀粉酶的最适pH值为6.8。 凡是能够提高酶活性，加快酶促反应速度的物质都称为酶的激活剂。例如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。 凡是能够降低酶的活性，使酶促反应速度减慢，又不使酶变性的物质称为酶的抑制剂。例如Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。 在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度不同，可由水解混合物遇碘显现的颜色不同来判断：淀粉(蓝色)红色糊精(红色)无色糊精(不显色)麦芽糖(不显色)葡萄糖(不显色) 二、实验步骤：1.制备稀释50倍的唾液淀粉酶：用蒸馏水漱口清除食物残渣，再含一口蒸馏水一分钟后使其流入量筒并稀释50倍，混匀备用。2.温度对酶促反应速度影响实验 （1）取试管3支，编号，各管按下表依次加入各种试剂。 温度对酶促反应速度影响实验加样表管号 1 2 3 0.1淀粉溶液（mL） 1.5 1.5 1.5稀释唾液 （ml） 1 1 1煮沸唾液 1摇匀水浴温度 37 0 37（2）水浴8min后，向各管中各滴加1滴KI-I2溶液，混匀，观察各管颜色并解释结果3.pH对酶促反应速度的影响实验（1）取试管3支，编号，按下表依次加入各种试剂。 pH对酶促反应速度影响实验加样表管号 1 2 30.2淀粉液（mL） 2 2 2PH 5.0缓冲液（mL） 3 PH 6.8缓冲液（mL） 3 PH 8.0缓冲液（mL） 3稀释唾液酶（mL） 2 2 2（2）混匀后，将各管置于37水浴5分钟后，取2号管中混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，以检验淀粉的水解程度。若不是棕黄色，则继续保温，然后每隔1min继续取2号管的混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管内依次滴加2滴KI-I2溶液显色。观察各管颜色并解释结果。4.激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响（1）取试管4支，编号，按下表依次加入各种试剂。激活剂和抑制剂对酶促反应速度影响实验加样表管号 1 2 3 40.1淀粉液（mL） 1.5 1.5 1.5 1.51NaCl溶液（mL） 2 1Na2SO4溶液（mL） 2 1CUSO4溶液（mL） 2 蒸馏水（mL） 2稀释唾液酶（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5（2）混匀后，将各管置于37水浴8分钟后，取1号管中混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，以检验淀粉的水解程度。若不是棕黄色，则继续保温，然后每隔1min继续取1号管的混合液1滴于点滴板上，加1滴KI-I2溶液显色，直至变成棕黄色时，向所有试管依次滴加1滴KI-I2溶液显色。观察各管颜色并解释结果。教学过程中师生活动设计 随着淀粉水解，为什么与碘有颜色反应变化？提纲、板书设计 原理及简要操作步骤作业 1在作离子对酶活的影响时3、4号管有何作用？2.在激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响实验中如何证明Cl-是唾液淀粉酶的激活剂？3.酶的抑制剂与变性剂有何区别？主要参考资料1生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，20102生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010总结分析1、对照实验要注意同步性；2、不同人的唾液淀粉酶活性不尽相同，让学生注意到样本差异；3、重点分析激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响医学生物化学实验教案 第 7次课 2学时实验项目 Folin-酚试剂法测蛋白质浓度 实验性质综合性实验 教学目的和要求1. 学习会用Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的方法。2. 巩固分光光度计的使用。教学重点与难点1、 重点：分光光度计的使用2、 难点：标准曲线的绘制实验材料试剂：标准蛋白溶液，Folin-酚试剂，样品液蛋白质器材：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管实验内容一、实验原理Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。二、实验步骤1.曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025）放置 10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin-酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。教学过程中师生活动设计 测定蛋白质浓度其他方法有哪些？提纲、板书设计原理及简要操作步骤作业 简述Folin-酚试剂法比较其他蛋白质测定方法的优点。主要参考资料1 生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，2010总结分析1、 强调Folin-酚试剂法测蛋白质浓度的显色原理；2、 巩固分光光度计的使用医学生物化学实验教案 第 8 次课 2学时实验项目 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳 实验性质基础性实验 教学目的和要求1.了解电泳技术的一般原理。2.掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。教学重 点与难点重点：掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作方法。难点：电泳技术的原理。实验材料器材：DYY-6型常压电泳仪、醋酸纤维薄膜（2 cm8cm）、.培养皿、盖玻片、滤纸、镊子。试剂：1 巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，用蒸馏水定容至1000mL。2 染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解（可重复使用）。3漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。4透明液（仅在定量分析时使用）：无水乙醇7份，冰醋酸3份，混匀。实验内容一、实验原理：电泳是带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在pH86的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象。影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的大小和形状。本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，它是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。本实验中用于电泳分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等，各种蛋白质在电场中的迁移速度不同。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白。二、实验步骤：1）预处理；2）点样：3）电泳；4）染色；5）漂洗，吸干。1.预处理：用镊子取醋酸纤维薄膜2张，识别出光泽面与粗糙面，将粗糙面朝上放在电泳槽中的缓冲液中浸泡20min。 2.点样：事先用点样器在滤纸上点几个样，熟悉一下点样器的用法。然后把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸内用手指快速捋一下，以吸干表面多余的液体，随即将粗糙面朝上平铺在玻璃板上。注意，切勿将膜条长时间放在滤纸上，以免膜条中的缓冲液过度吸出。用盖玻片蘸一点血清，使血清均匀地分布在盖玻片切面。将盖玻片在膜条一端23cm处轻轻地垂直落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品，每张膜点一个样。（要求：轻、匀、直、细）3电泳：预先要在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，做好滤纸桥。用镊子将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，要平直。膜条光面朝上，点样端靠近负极、且悬空（可用镊子再将膜条两端压服帖一些）。盖严电泳室，检查一下电泳槽和稳压电源是否已经连接好。通电，调节电压至110V，电泳时间约为30min。4染色：电泳完毕后，关上电源开关，用镊子将薄膜条取下并放在装有染色液的培养皿中浸泡34min（注意盖好培养皿的盖子，以免溶剂挥发）。5漂洗：将膜条从染色液中取出，在培养皿的边缘上沥去表面多余的染色液，依次放入装有漂洗液的培养皿（共有2套）中漂洗2次（未漂洗时注意盖好培养皿的盖子，以免溶剂挥发），至色带清晰的电泳图谱。三、分析结果：实验采用小牛血清故出现三条色带：清蛋白；1球蛋白；2球蛋白，且清蛋白颜色最深。（本实验由于时间有限，授课时间安排首先由教师简单讲解实验步骤并向学生演示操作方法后指导学生操作，在电泳的30min里教师给学生详尽讲解实验原理，操作步骤及其注意事项。）教学过程中师生活动设计 蛋白质颗粒为什么能电泳？依据什么性质？提纲、板书设计原理及简要操作步骤作业1.电泳时，醋酸纤维薄膜点样的一端应靠近哪一极？为什么？2.血清醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白依次分为哪几条区带？主要参考资料1 生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，2010总结分析1、需要强调点样方法，避免点样过多，重复点样等；2、重点讲解迁移速率的因素；3、结合血清电泳在医学检验领域的应用，便于学生更好的理解医学生物化学实验教案 第 9次课 2学时实验项目 血清ALT活性测定 实验性质综合性实验 教学目的和要求掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理、具体操作方法了解其临床意义。教学重 点与难点重点：血清谷丙转氨酶活性测定的原理。难点：血清谷丙转氨酶活性测定的方法。实验材料试剂：0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液、0.4mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氢氧化钠溶液、ALT底物液、2，4-二硝基苯肼溶液、丙酮酸标准液。材料：分光光度计、恒温水浴锅、试管、移液管、容量瓶、量筒。实验内容一、实验原理：丙酮酸可与2，4-二硝基苯肼在酸性溶液中反应形成相应的2，4-二硝基苯腙，呈黄色，后者在碱性条件下呈红棕色。通过测定其在520nm波长处的光吸收来了解丙酮酸的生成量，借此测定血清ALT的活力，故该类方法又称比色测定法。该法虽然也有缺点，但操作简便，不需要特殊仪器和试剂，故在临床上被广泛应用。该法的单位定义是：每lmL血清在pH7.4，37保温条件下与底物作用30分钟，每生成2.5g丙酮酸为一个单位。人血清的丙氨酸氨基转移酶正常值为240U。二、实验步骤：1.酶活反应体系的配制试剂测定管（1）测定对照管（2）标准管（3）标准对照管（4）ALT底物（mL）0.50.50.537度保温5min（预热，可略）血清（mL）0.20.2-丙酮酸标液（200ug/ml)-0.2-磷酸buffer（mL）-0.2混匀，37度保温30min2,4-二硝基苯肼（mL）0.50.50.50.5混匀，37度保温20minALT底物（mL）-0.50.50.50.4mol/NaOH（mL）5.05.05.05.02.反应后吸光值的读取以dH2O为空白对照测四管的A值3.酶活性的计算公式：教学过程中师生活动设计 什么是酶的比活力？提纲、板书设计原理及简要操作步骤作业 混浴各管后，为何要在10min后，30min内测其吸光值？主要参考资料1 生物化学实验，何幼鸾、汤文浩，华师出版社，20132生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，2010总结分析1、 原理讲解要结合血清ALT活性测定在医学检验领域的应用；2、 整个实验过程中加样和操作过程需规范，否则数据差距较大；3、 帮助学生推导酶活性的计算公式医学生物化学实验教案 第 10次课 2学时实验项目 维生素C含量测定实验性质基础性实验 教学目的和要求学习测定VC含量的原理和方法掌握微量滴定管使用方法教学重 点与难点重点：滴定操作难点：计算方法实验材料试剂：辣椒匀浆（样品VC）、标准VC，2，6-二氯酚靛酚溶液。器材：容量瓶，微量滴定管、小三角瓶、1草酸、2草酸、移液管。实验内容一、实验原理：氧化型2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈粉红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色，还原型2，6-二氯酚靛酚无色。当用此染料滴定含有Vc的酸性溶液时，在Vc未全部氧化前，滴下的染料立即被还原成无色；一旦溶淀中的Vc全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液显示粉红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的Vc刚刚被氧化完全。因此，从滴定时2，6一二氯酚靛酚标准液的消耗量，可以计算出被检物质中Vc的含量。二、实验步骤：1辣椒匀浆的稀释取辣椒匀浆7mL（计为5.0g），装入小容量瓶，用2草酸稀释定容至50mL刻度线。2标准VC的滴定 吸取标准VC（0.1mg/mL）1.0ml置于锥形瓶中，加9mL 1草酸混匀，用装有2，6-二氯酚靛酚的微量滴定管滴定至淡红色（保持5s不褪去）为终点，记下所用体积V标3样品VC的滴定 从1中取10mL，放入锥形瓶，用2，6-二氯酚靛酚滴定，方法同上，作两次平行实验。取消耗体积的平均值，记下体积V样三、样品VC浓度的计算：经草酸稀释后的辣椒匀浆中VC浓度为：每100g纯辣椒中含VC的mg数为：注意：整个实验要迅速，以防VC氧化。教学过程中师生活动设计 VC作用及缺乏症提纲、板书设计原理及简要操作步骤作业 本实验中为何用草酸稀释VC，而不用纯水？主要参考资料1生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，20102生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010总结分析1、滴定前要提醒检查滴定管的气密性，装溶液后还要排气泡，微量滴定管需正确使用；2、结果计算较复杂，帮助推导和理解医学生物化学实验教案 第 11次课 2学时实验项目 血清胆固醇的测定实验性质设计性实验 教学目的和要求1.学习测定胆固醇的原理2.掌握化学比色法测定胆固醇的方法教学重 点与难点重点：血清中胆固醇测定的原理难点：胆固醇测定方法实验材料仪器：离心机、离心管、试管、刻度吸量管、722型分光光度计。试剂：10%三氯化铁溶液、磷硫铁试剂、胆固醇标准储存液、胆固醇标准溶液实验内容一、实验原理： 本实验采用化学比色法测定总胆固醇（包括游离型胆固醇和胆固醇酯）。血清经无水乙醇处理后，蛋白质沉淀出来，胆固醇则溶于其中。在乙醇提取液中加磷硫铁试剂、胆固醇试剂产生紫红色化合物，颜色深浅与胆固醇总量成正比，可用分光光度计法测定。二、实验步骤：（1）吸取0.1mL血清置于干燥的离心管内，先加无水乙醇0.4mL，摇匀后再加无水乙醇2.0 mL，摇匀，10 min后离心（3000r/min 5 min），取上清备用。（2）取3支干燥试管，编号，分别加入无水乙醇1.0 mL（空白管）、胆固醇标准溶液1.0 mL（标准管）、上述乙醇提取液1.0 mL(样品管)，各管皆加入磷硫铁试剂1.0 mL，摇匀，10 min后分别转移至0.5 cm比色皿愉，用722型分光光度计在560 nm波长下比色。三、结果计算： 血清胆固醇含量（mg/mL）=A2/A1*0.08/0.04=A2/A1*2式中： A1为标准溶液的吸光度；A2为样品液的吸光度人血清胆固醇的正常含量为2.8-5.7 mmol/L教学过程中师生活动设计思考人体内胆固醇的生理作用及正常含量提纲、板书设计原理及简要操作步骤作业 计算公式中0.08和0.04各代表什么意义主要参考资料1生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，20102生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010总结分析1、重点讲解血清胆固醇的测定原理；2、再次复习分光光度计使用要熟练医学生物化学实验教案 第 12次课 2学时实验项目 牛奶中提取酪蛋白实验性质基础性实验 教学目的和要求1.学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。2.了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。教学重点与难点重点：从牛奶中制取酪蛋白的原理难点：加乙醇和水的目的实验材料鲜牛奶、恒温水浴锅、台式离心机、抽滤装置。试剂：95%乙醇；无水乙醚；0.2mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液实验内容一、实验原理：牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100mL。酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.251.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH值调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。二、实验步骤：1.将5mL牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40，在搅拌下漫漫加入预热至40（应注意两种液体都应先预热至40再用），pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7(用1%NaOH或10%醋酸溶液进行调整)。观察牛奶开始有絮状沉淀出现后，保温一定时间使沉淀完全。将上述悬浮液冷却至室温。离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品；2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上清液；3.在沉淀中加入3mL95%的乙醇，搅拌片刻；4.将沉淀摊开在表面皿上，烘干，得酪蛋白精制品；5.称取所获酪蛋白的质量（g）。4、 实验结果与计算：计算含量和得率：酪蛋白含量（g/mL）=酪蛋白（g）/50mL100%；得率=测得含量/理论含量100%。教学过程中师生活动设计 牛奶中蛋白质成份，牛奶的营养提纲、板书设计原理及简要操作步骤作业设计另一种方法提取蛋白的方法。主要参考资料1生物化学实验，董晓燕主编，化学工业出版社，20102生物化学实验教程，王金亭，方俊主编，华中科技大学出版社，2010课后自我总结分析1、 学习离心机的使用；2、 等电点的调节直接影响得率，PH要调节准确医学生物化学实验教案 第 13次课 2学时实验项目 卵磷脂的提取与鉴定实验性质基础性实验 教学目的和要求1.掌握卵磷脂的提取鉴定的原理和方法。2.验证卵磷脂水解后的产物，巩固对卵磷脂组成结构的认识。教学重点与难点重点：掌握卵磷脂的提取和鉴定的原理难点：如何去除蛋黄中除卵