注射用重组人促卵泡激素制造及检定暂行规程

注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 1 注射用重组人促卵泡激素制造及检定暂行规程注射用重组人促卵泡激素制造及检定暂行规程 本品系由含有高效表达人促卵泡激素基因的中国仓鼠卵巢 CHO 细胞 经过细胞培养 分离和高度纯化后冻干制成 含有维持其稳定性作用的保护剂 不含防腐剂和抗生素 适应症为 不排卵 包括多囊卵巢综合症 PCOD 且对 枸橼酸克罗米酚治疗无反应的妇女 对于进行超排卵期或辅助生育技术 如 体外受精 胚胎移植 IVF 配子输卵管内移植 GIFT 和合子输卵管内移植 ZIFT D 的患者 本品可刺激多卵泡发育 1 基本要求基本要求 1 1 设施与生产质量管理 按中国 药品生产质量管理规范 要求实施 1 2 原料及辅料 应符合现行 中华人民共和国药典 2005 版二部或 中国生物制品主要原 辅材料质控标准 的要求 未纳入上述标准的化学试剂 应不低于化学纯 1 3 生产用水 生产用水源水应符合饮用水标准 纯化水及注射用水应符合现行 中华人 民共和国药典 2005 版二部标准 1 4 生产用器具 直接用于生产的金属或玻璃等器具 应经过严格清洗及去热原质处理或灭 菌处理 2 制造制造 2 1 工程细胞 2 1 1 名称及来源 重组人促卵泡激素工程细胞系由带有人促卵泡激素 和 链基因的重组质 粒共转染的 CHO K1 细胞系 2 1 2 种子库建立 传代及保存 从原始细胞库的细胞传代 扩增后冻存于液氮中 作为主细胞库 从主细 胞库传代 扩增后冻存于液氮中 建立工作细胞库 每次传代不超过批准的代 次 细胞系冻存于液氮中 检定合格后方可用于生产 2 1 3 主细胞库及工作细胞库细胞的检定 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 2 应符合 生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程 规定 2 1 3 1 外源因子检查 细菌和真菌 附录 XII A 支原体 附录 XII B 病毒检查 附录 XII C 2 1 3 2 细胞鉴别实验 应用同工酶分析 生物化学 免疫学 细胞学和遗传学标记物等任一方法 进行鉴别 应为典型 CHO 细胞 2 1 3 3 重组人促卵泡激素表达量 应不低于原始细胞库细胞表达量 2 2 原液 2 2 1 细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后 于无血清 无蛋白培养基中进行传代和 扩增 供转瓶或细胞培养罐接种用 2 2 2 细胞培养液 生产用培养液应不含血清 蛋白质 2 2 3 细胞培养 细胞培养全过程应严格按照无菌操作 细胞培养时间根据细胞生长情况而 定 2 2 4 分离纯化 收集的培养液经过超虑法进行浓缩 经多步色谱纯化后得到高纯度的重组 人促卵泡激素 即为重组人促卵泡激素原液 除菌过滤后保存于适宜温度 并 规定其有效期 2 2 5 原液检定 按照 3 1 项进行 2 3 半成品 2 3 1 配置与除菌 原液加入适宜的稳定剂 并用缓冲液稀释 除菌过滤后即成半成品 2 3 2 半成品检定 按照 3 2 项进行 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 3 2 4 成品 2 4 1 分批 应符合 生物制品分批规程 规定 2 4 2 分装及冻干 应符合 生物制品分装和冻干规程 规定 半成品应及时分装 冷冻 冻 干的全过程中 制品的温度应不高于 30 2 4 3 规格 75IU 瓶 2 4 4 包装 应符合 生物制品包装规程 规定 3 3 检定检定 3 1 原液检定 3 1 1 性状 应为无色澄明液体 3 1 2 鉴别 3 1 2 1 在氧化亚基项下记录的色谱图中 供试品主峰保留时间应与对照 品一致 3 1 2 2 在含量测定项下记录的色谱图中 供试品主峰的保留时间应与对 照品一致 3 1 2 3 肽图 至少每半年测定一次 取本品 照附录 1 测定 肽图谱应与对照品一致 3 1 2 4 N 末端氨基酸序列 至少每一年测定一次 将本品烷基化处理 再经 HPLC 分离纯化得到 链后 通过 Edman 降解法测序 两条链 N 末端 15 个氨基酸序列分别为 链 A P D V Q D C P E C T L Q E N 链 N S C E L T X I T I A I E K E 其中 X 代表未测出氨基酸 可能有修饰 3 1 3 检查 3 1 3 1 等电点 取本品 照附录 2 测定 等电点主区带应在 3 5 5 5 之间 供试品主区带应 与对照品一致 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 4 3 1 3 2 解离亚基 取本品 1 0 mg ml 50ul 加 2 非还原上样缓冲液 50ul 混匀即得供试品 溶液 取上述供试品溶液 10ul 加入 190ul 1 非还原上样缓冲液 混匀后 100 加热 5 分钟 放冷即得对照溶液 供试品溶液 5 依法 药典 2005 版三部 附录 IV C 考马斯亮蓝法 用非还原 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测 分离 胶浓度为 12 5 供试品溶液和对照溶液各取 20ul 考马斯亮蓝染色 凝胶成 像仪扫描记录结果 供试品中解离亚基条带显色应不深于对照溶液中的解离亚 基条带 5 3 1 3 3 氧化亚基 照高效液相色谱法 中国药典 2005 年版三部 附录 III B 测定 色谱条件与系统适用性试验 用 Vydac Protein and Peptide C4柱 25cm 4 6mm 5um 或同等产品 以 0 1mol L TEAP 缓冲液 取 85 磷酸 6 75ml 加水 950ml 用三乙胺调 pH 值至 6 00 0 05 加水至 1000ml 0 45um 滤膜滤过 放置 24 小时后使用 为流动相 A 乙腈为流动相 B 0 1 三氟乙酸 的 80 乙腈溶液为流动相 C 洗柱液 流速为 1 0ml min 柱温为 40 检测 波长为 214nm 梯度程序为 时间 min A B C 086140 5672280 5700100 7200100 7386140 取本品 0 5mg ml 200 l 加入 1 双氧水溶液 4 l 反应 30 分钟即为系 统适用性试验用样品溶液 取 20 l 注入液相色谱仪 记录色谱图 相对 亚基 保留时间约为 0 86 的杂质峰即为氧化亚基峰 测定法 取本品 0 5mg ml 20 l 注入液相色谱仪 记录色谱图 按峰 面积归一化法计算 氧化亚基含量不得高于总蛋白量的 10 3 1 3 4 聚合体 取本品原液浓度不定 0 1mg ml 80 l 加入 5 非还原样品缓冲液 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 5 20 l 混匀作为供试品溶液 取供试品溶液适量 用 1 非还原样品缓冲液稀释 为供试品溶液的 2 作为对照品溶液 取供试品溶液与对照溶液各 25 l 依 法检查 药典 2005 版三部 附录 IV C 银染法 分离胶浓度为 12 5 对照 品条带应显色 供试品中聚合物带的显色应不深于对照品的主带 2 3 1 3 5 唾液酸含量 精密配制浓度分别为 0ug ml 40ug ml 80ug ml 120ug ml 160ug ml 200ug ml 的唾液酸对照品作 标准曲线 取本品 依法测定 药典 2005 版三部 附录 VI E 唾液酸含量应 为 1 41 12 84 范围太大 3 1 3 6 紫外光谱扫描 取本品适量 用原液空白溶剂 10mM PB 0 1M NaCl 稀释为 200ug ml 以空白溶剂为参比 在波长 230 330nm 范围 依法 药典 2005 版三部 附录 II A 检查 最大吸收波长应在 276 3nm 处 3 1 3 7 宿主 DNA 残留量 取本品 依法测定 药典 2005 版三部 附录 IX B 每剂量重组人促卵泡 激素应不高于 100pg 3 1 3 8 CHO 细胞蛋白残留 取本品 照 CHO 宿主细胞蛋白 ELISA 检测试剂盒 Cygnus 方法测定 分别用样品稀释液稀释至 1mg ml 作为供试品溶液 取 200ng ml CHO 宿主蛋白 标准品溶液 50ul 并加入 200ul 供试品溶液 作为回收率实验溶液 按照试剂 盒说明书进行操作 每 1mg 重组人促卵泡激素中 CHO 宿主蛋白残留不得过 25ng 3 1 3 9 鼠 IgG 残留量测定 取本品 依法测定 药典 2005 版三部 附录 IX L 每剂量重组人促卵泡 激素中鼠 IgG 残留应不高于 10ng 3 1 3 10 细菌内毒素 依法测定 药典 2005 版三部 附录 XII E 凝胶限量试验 每 1mg 重组人 促卵泡激素应不高于 10EU 3 1 4 含量测定 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 6 取重组人促卵泡激素对照品适量 用水制成每 1ml 含有 0 1mg 的溶液作为 对照品溶液 照高效液相色谱法 中国药典 2005 版三部 附录 III B 测定 用 TSK gel G 2000SWXL 30cm 7 8mm I D 或其它相应的色谱柱 以磷酸盐 缓冲液 取 85 H3PO4 6 74ml 加水 800ml 再加 Na2SO4 14 2g 用 50 NaOH 调 pH 至 6 70 0 05 用水定溶为 1000ml 后抽滤 为流动相 流速为 1 0ml min 检测波长为 214nm 取对照品 20 l 注入液相色谱仪 记录色谱图 以人促卵泡激素峰计 理论塔板数应不小于 1000 另取供试品适量注入液相色 谱仪 记录色谱图 按外标法计算 即得 3 1 5 生物活性测定 取本品依法检定 中国药典 2005 版二部 附录 XII M 卵泡刺激素生物测 定法检定 每 1mg 重组人促卵泡激素生物活性应不低于 9000IU 3 2 半成品检定 3 2 1 细菌内毒素检查 依法 药典 2005 版三部 附录 XII E 凝胶限量试验 检查 每 6 g 重 组人促卵泡激素不得过 2EU 3 2 2 含量测定 按照成品含量测定项下方法进行 根据结果对半成品分装体积进行微调 保证成品蛋白含量 3 3 成品检定 3 3 1 性状 本品为白色疏松体 复溶后为无色澄明液体 3 3 2 鉴别试验 3 3 2 1 在含量测定项下记录的色谱图中 供试品主峰的保留时间应与对 照品峰的保留时间一致 3 3 2 2 供试品 抗体如何配制 依法检定 药典 2005 版三部 附录 VIII B 免疫斑点法 应符合规定 3 3 3 检查 3 3 3 1 复溶时间 取本品 每支加注射用水 0 5ml 溶解 溶解时间不得过 2 分钟 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 7 3 3 3 2 不溶性微粒 取本品 用注射用水溶解后 依法 中国药典 2005 年版二部附录 IX C 检查 每瓶中 10 m 以上的微粒不得过 6000 粒 25 m 以上的微粒不得过 600 粒 3 3 3 3 水分 取本品 依法 药典 2005 版三部 附录 VII D 第一法 B 库仑滴定法 检 查 含水分不得过 3 0 3 3 3 4 酸碱度 取本品 每支加附带注射用水 0 5ml 溶解 依法 药典 2005 版三部 附 录 V A 检查 pH 应为 6 5 7 5 3 3 4 聚合体 取本品 每瓶加入 80 l 注射用水溶解 加入 5 非还原样品缓冲液 20 l 混匀作为供试品溶液 取供试品溶液 10 l 加 1 非还原样品缓冲液 490 l 作为 对照溶液 取供试品溶液与对照溶液各 25 l 依法检查 药典 2005 版三部 附 录 IV C 银染法 对照溶液条带应显色 供试品中聚合物带的显色应不深于对 照溶液的主带颜色 2 3 3 5 氧化亚基 色谱条件与系统适用性试验 照高效液相色谱法 中国药典 2005 年版三部 附录 III B 测定 色谱条件与系统适用性试验 用 Vydac Protein and Peptide C4柱 25cm 4 6mm 5um 或同等产品 以 0 1mol L TEAP 缓冲液 取 85 磷酸 6 75ml 加水 950ml 用三乙胺调 pH 值至 6 00 0 05 加水至 1000ml 0 45um 滤膜滤过 放置 24 小时后使用 为流动相 A 乙腈为流动相 B 0 1 三氟乙酸 的 80 乙腈溶液为流动相 C 洗柱液 流速为 1ml min 柱温为 40 检测波 长为 214nm 梯度程序为 时间 min A B C 086140 5672280 5700100 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 8 7200100 7386140 取本品 0 5mg ml 200 l 加入 1 双氧水溶液 4 l 反应 30 分钟即为系 统适用性试验用样品溶液 取 20 l 注入液相色谱仪 记录色谱图 相对 亚基 保留时间约为 0 86的杂质峰即为氧化亚基峰 需确认 测定法 取本品适量 每瓶加水 100 l 溶解 合并 混匀作为供试品溶液 取供试品溶液 200 l 注入液相色谱仪 记录色谱图 按峰面积归一化法计算 氧 化亚基不得过 10 3 3 6 含量测定 取重组人促卵泡激素对照品适量 用水制成每 1ml 含有 0 03mg 的溶液作为 对照溶液 取本品 每瓶加水 250 l 溶解作为供试品溶液 照高效液相色谱法 中国药典 2005 版三部 附录 III B 测定 用 TSK gel G 2000SWXL 30cm 7 8mm I D 或其它相应的色谱柱 以磷酸盐缓冲液 取 85 H3PO4 6 74ml 加水 800ml 再加 Na2SO4 14 2g 用 50 NaOH 调 pH 至 6 70 0 05 用水定溶为 1000ml 后抽滤 为流动相 流速为 1 0ml min 检测波 长为 214nm 分别取对照品和供试品 100 l 注入液相色谱仪 记录色谱图 以 人促卵泡激素峰计 理论塔板数应不小于 1000 按外标法计算 即得 重组人 促卵泡激素含量应为标示量的 90 110 3 3 7 生物活性测定 取本品 供试品 标准品如何配制 依法 药典 2005 版二部 附录 XII M 卵泡刺激素生物测定法检定 重组人促卵泡激素的生物活性应为标示量的 80 150 3 3 8 无菌检查 取本品 用注射用水溶解 依法 药典 2005 版三部 附录 XII A 膜过滤 法 检查 应符合规定 3 3 9 细菌内毒素 取本品 用注射用水溶解后 依法 药典 2005 版三部 附录 XII E 凝胶限 量试验 检查 每支成品含细菌内毒素不得过 5EU 3 3 10 异常毒性 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 9 取本品 用注射用水溶解 依法 药典 2005 版三部 附录 VII F 小鼠实验 法 检查 应符合规定 4 4 保存 运输及有效期 保存 运输及有效期 低于室温下保存及运输 有效期暂定 2 年 5 5 使用说明 使用说明 应符合 生物制品包装规程 规定 6 6 附录 附录 6 1 肽图检测方法 6 1 1 仪器及耗材 恒温水浴 磁力搅拌器 小型冻干机 氮气瓶 台式离心机 透析袋 3 10kd 超滤离心管 5kd 孔径 4ml 通风橱 6 1 2 试剂和溶液 6 1 2 1 盐酸胍溶液 6mol L 称取盐酸胍 14 3g 至 25 0ml 容量瓶 加水溶解并定容 即得 6 1 2 2 TE 缓冲液 Tris 0 2mol L EDTA 1mmol L pH8 3 称取 Tris 1 2g EDTA 18 6mg 加 40ml 水溶解 用 2mol L 盐酸调节 pH 至 8 3 移入 50ml 容量瓶 用水定容 6 1 2 3 还原及酰化试剂 盐酸胍缓冲液 取盐酸胍溶液 1 2ml TE 缓冲液 0 4ml 混匀即得 用前配 制 DTT 溶液 9 0mg ml 称取 DTT 约 9mg 加入 1 0ml 盐酸胍缓冲液 2 8 保存 碘乙酸溶液 130mg ml 称取碘乙酸 65mg 加入 0 5ml 盐酸胍缓冲液溶 解 用铝箔避光保存 氮气充封后存于 20 6 1 2 4 0 1 TFA 溶液 取 100ul TFA 加入 100ml 水中 室温 1 月 6 1 2 5 含 0 1 TFA 的 45 乙腈溶液 2 8 保存 1 月 6 1 2 6 V8 蛋白酶缓冲液 Tris HCl 50mM pH7 8 称取 Tris 0 6g 溶于 80ml 水 2mol L HCl 调节 pH 至 7 8 定容至 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 10 100ml 2 8 保存 1 月 6 1 2 7 流动相 A 5 乙腈 0 1 TFA 的水溶液 6 1 2 8 流动相 B 90 乙腈 0 1 TFA 的水溶液 6 1 3 样品溶液制备 6 1 3 1 对照品溶液制备 取果那芬对照品适量 用水透析后离心浓缩至 浓度约为 3mg ml 6 1 3 2 供试品溶液制备 取原液 同法制备 6 1 4 去糖基化 6 1 4 1 取对照品和供试品各 150ul 加入 20ul 10 PNGaseF 缓冲液 按 照说明书要求分别加入 6ul SDS 巯基乙醇溶液和 6ul NP 40 溶液 混匀后加 入 5ulPNGaseF 酶 30 保温 24 小时 6 1 4 2 100 处理 10 分钟灭活糖苷酶 6 1 4 3 加水稀释至 4ml 用 4ml 超滤离心管离心除盐 并缩小体积至 200ul 并干燥样品 6 1 5 还原烷基化 6 1 5 1 还原 将干燥样品回溶于 200ul 盐酸胍缓冲液中 加入 100ul DTT 溶液 氮气流处理 封口后 37 反应 1 小时 6 1 5 2 烷基化 在上述样品管中加入 20ul 碘乙酸溶液 氮气流处理 封 口后 37 反应 1 小时 加入 300ul 0 1 TFA 溶液终止反应 再加入 30ul 巯 基乙醇 通风橱内操作 室温反应 15min 6 1 5 3 用水透析脱盐后冻干样品 6 1 6 V8 蛋白酶切 6 1 6 1 蛋白酶溶液制备 取酶适量 用水溶解制备为 1mg ml 6 1 6 2 取冻干样品 每管加入 300ul 蛋白酶缓冲液 Tris HCl 50mM pH7 8 回溶 加入 15ul 蛋白酶溶液 37 反应 16 小时 6 1 7 RP HPLC 分析 色谱柱 C18 300 5 m 4 6 250mm 色谱条件 波长 214nm 流速 1 0ml min 柱温 30 进样量 180ul 针 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 11 洗脱条件 T min 流动相 A 流动相 B 0 1000 3 1000 15 8020 456535 60 4060 610100 700100 711000 6 1 8 观察结果 6 26 2 等电点测定等电点测定 6 2 1 主要仪器 Pharmacia平板电泳仪 或者同等产品 电泳冷却板 制胶模具 6 2 2 主要试剂 丙烯酰胺 N 甲叉双丙烯酰胺 十二烷基硫酸钠 SDS 过硫酸氨 AP TEMED pI等电点标准蛋白marker 载体两性电解 质pH3 10 甲基红 6 2 3 溶液配制 6 2 3 1 10 丙烯酰胺贮液 称取丙烯酰胺 5 0g 甲叉双丙烯酰胺 0 15g 加水溶解 定容至 50ml 滤 纸过滤 6 2 3 2 电极液 阳极液 1mol L 磷酸溶液 取浓磷酸 3 2ml 加水至 50ml 阴极液 1mol L NaOH 溶液 6 2 3 3 50 甘油 称取甘油 50g 加水混合均匀后定容至 100ml 6 2 3 4 甲基红指示剂 称取甲基红 0 1g 加入 7 4ml NaOH 0 05mol L 使之溶解 加水定容至 200ml 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 12 6 2 3 5 固定液 10 TCA 称取三氯乙酸 10g 加水溶解 用水定容至 100ml 6 2 3 6 脱色液 取甲醇 25ml 乙酸 5ml 加水至 100ml 6 2 3 7 染色液 称取考马氏亮蓝 R 250 0 1g 用脱色液定容至 100ml 6 2 3 8 0 025mol L 磷酸缓冲液 pH7 0 溶液 A Na2HPO4 12H2O18 81g 加水溶解并定溶于 100ml 溶液 B 柠 檬酸钠 2H2O 2 39g 加水溶解并定溶于 100ml 取溶液 A 82 4ml 溶液 B 17 6ml 混匀 取 25ml 加水至 1000ml 即得 6 2 4 操作步骤 6 2 4 1 凝胶制备 按照下表进行配制 10 丙烯酰胺贮液2 5ml 载体两性电解质0 35ml 50 甘油0 5ml 水1 25ml 10 APS25 l TEMED6 l 6 2 4 2 样品制备处理 依具体情况而定 如果供试品和对照品溶液盐浓度过高 应先透析或过滤 除盐 样品浓度制成 0 5 2 0mg ml 分别取供试品及对照品溶液各 10 l 加入 两性电解质 2 l 加入甲基红试液 0 5 l 6 2 4 3 电泳 6 2 4 3 1 点样 将滤纸片剪成 0 5cm 0 5cm 大小 排放在凝胶上 分别将样品 对照品及 等电点标准液各 10 l 点在滤纸上 6 2 4 3 2 预电泳 开机预冷电泳槽冷却板 在冷却板中央滴加石蜡油 将载胶的支持膜铺在 油上 6 预冷 30min 将电极条分别用阴 阳极电极液充分湿润 吸去多余电 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 13 极液后平行置于凝胶两端 将电极压在电极条上 200V 预电泳 20min 6 2 4 3 3 电泳 200V 恒压 20min 然后根据情况调整电压 直至电流不再降低为止 6 2 4 4 显色 胶片于固定液中固定 30 60min 于脱色液中平衡 20min 于染色液中染色 20 60min 最后于脱色液中脱色至本底无色 6 2 5 观察结果 根据等电点标准蛋白判断样品等电点 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 14 注射用重组人促卵泡激素制造及检定规程起草说明注射用重组人促卵泡激素制造及检定规程起草说明 我公司研制生产的注射用重组人促卵泡激素 rhFSH 是利用中国仓鼠卵 巢 CHO 细胞分泌型表达技术 使目的蛋白直接分泌于培养基中 经过一系 列的下游纯化及冻干等工艺步骤和严格的质量检验而获得的真核基因工程产品 为了获得高质量的基因工程重组人 FSH 产品 在制备和检定过程中 我们按 中华人民共和国药典 2005 版 和 中国生物制品规程 2000 版 对生物 制品质量控制要点的要求 结合连续中试生产的三批样品 批号 20050701 20050702 20050703 的质量研究结果 参照同类进口产品果纳芬 质量标准 起草了重组人促卵泡激素原液和成品的检定规程 现说明如下 1 1 重组人促卵泡激素原液 重组人促卵泡激素原液 1 11 1 性状性状 根据中试产品质量研究结果 三批注射用重组人促卵泡激素原液均为无色 澄清液体 无肉眼可见不溶物 由于本品为注射剂 依据 中华人民共和国药 典 2005 版二部对注射剂标准的要求 规定本品为无色澄清液体 不得含有肉 眼可见不溶物 1 21 2 鉴别鉴别 本产品含量和氧化亚基项目的检查都采用了 HPLC 的方法 在此基础上 我 们通过将待测样品与对照品保留时间的对比 清晰的反应出了蛋白质的性质 对产品进行了可靠的鉴别 三批注射用重组人促卵泡激素原液的主峰保留时间 与对照品主峰保留时间均一致 1 31 3 肽图肽图 为了确证产品结构的正确性 我们规定至少每半年进行一次产品的肽图谱 分析 由于重组人促卵泡激素是一种真核细胞为宿主表达的经糖基化修饰的蛋 白 我们通过糖酶和 TPCK 处理的胰蛋白酶先后作用待测样品和对照品 将其 蛋白链分解成若干肽段 然后利用 RP HPLC 进行了有效地分离 结果表明三批 注射用重组人促卵泡激素原液肽图谱与果纳芬 对照品完全一致 1 41 4 等电点等电点 根据文献报道 1 重组人促卵泡激素的等电点主区带应在 4 0 5 2 之间 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 15 而在我们建立的等电聚焦电泳系统结果分析表明 三批注射用重组人促卵泡激 素原液与果纳芬对照品的主区带分布一致 均在 3 5 5 5 之间 1 51 5 N 末端氨基酸序列 末端氨基酸序列 为了确证产品结构的正确性 我们规定至少每年测定一次产品的 N 末端 15 个氨基酸序列 将本品烷基化处理 再经 HPLC 分离纯化得到 链后 通 过 Edman 降解法测序 两条链 N 末端 15 个氨基酸序列分别为 链 A P D V Q D C P E C T L Q E N 链 N S C E L T X I T I A I E K E 其中 X 代 表未测出氨基酸 可能有修饰 这与文献报道的理论序列是相同的 1 61 6 解离亚基解离亚基 依法 药典 2005 版三部 附录 IV C 考马斯亮蓝法 用非还原 SDS 聚 丙烯酰胺凝胶电泳法检测 考马斯亮蓝染色 凝胶成像仪扫描记录结果 同法 参考果纳芬的检定标准 将解离亚基的含量定为小于 5 1 71 7 氧化亚基氧化亚基 重组人促卵泡激素的氨基酸结构中含有六个甲硫氨酸残基 容易受到氧化 产生无活性的氧化产物 实测三批原液氧化亚基的含量都在 1 5 之间 我们 参考果纳芬对此项的要求为不得高于总蛋白量的 10 所以起草标准同果纳芬 进口注册标准 1 81 8 聚合体聚合体 重组人促卵泡激素由两条链以非共价连接的形式构成 很容易形成高分子 聚合物 我们参考果纳芬对此项的检定方法 结合三批原液高分子含量检定结 果 将聚合体含量的标准规定为不得高于总蛋白量的 2 1 91 9 唾液酸含量唾液酸含量 根据文献报道 重组人促卵泡激素唾液酸含量能够直接的反应其糖基化修 饰的程度 而糖基化修饰又与蛋白的活性密切相关 我们建立了 C18 RP HPLC 分析唾液酸含量的方法 对三批原液进行的检定 结果分别为 7 717 7 824 7 679 所以将重组人促卵泡激素原液唾液酸含量规定为 5 15 1 101 10 紫外光谱扫描紫外光谱扫描 依法 药典 2005 版三部 附录 II A 检查 重组人促卵泡激素三批原液与 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 16 果纳芬对照品的吸收谱图一致 最大吸收波长应在 276 3nm 处 1 111 11 宿主宿主 DNA 残留量残留量 依法 药典 2005 版三部 附录 IX B 测定 三批重组人促卵泡激素每剂 量重组人促卵泡激素应不高于 100pg 1 121 12 CHO 细胞蛋白残留细胞蛋白残留 照 CHO 宿主细胞蛋白 ELISA 检测试剂盒 Cygnus 方法测定 三批重组 人促卵泡激素原液的残留量值分别为 1 650ng mg 1 114ng mg 1 194ng mg 所以规定每 mg 重组人促卵泡激素中 CHO 宿主蛋白残留不得过 25ng 1 131 13 鼠鼠 IgG 残留量测定残留量测定 本产品的生产纯化工艺中 有针对重组人促卵泡激素的单克隆抗体亲和层 析 所以产品中不可避免会有一些鼠源 IgG 残留 依法 药典 2005 版三部 附 录 IX L 测定 三批重组人促卵泡激素原液的鼠源 IgG 残留量分别为 0 602 ng 剂量 0 750 ng 剂量 0 869ng 剂量 所以规定每剂量重组人促卵泡激素应不高 于 10ng 1 141 14 细菌内毒素细菌内毒素 依法 药典 2005 版三部 附录 XII E 凝胶限量试验 测定 三批重组人促 卵泡激素原液的细菌内毒素都小于 5EU mg 所以规定每 1mg 重组人促卵泡激 素应不高于 10EU 1 151 15 比活测定比活测定 参考果纳芬的含量检测方法进行定量 按照药典 2005 版二部 附录 XII M 卵泡刺激素生物测定法检定生物活性 三批重组人促卵泡激素原液的比活性都 在 12000 13000IU mg 之间 所以规定每 1mg 重组人促卵泡激素生物活性应不 低于 9000IU10000IU mg 2 2 注射用重组人促卵泡激素注射用重组人促卵泡激素 2 12 1 鉴别试验鉴别试验 结合含量检定项下保留时间与免疫学性质分析 提供了稳定可靠的鉴别实 验方法 三批重组人促卵泡激素成品与果纳芬的 SEC HPLC 保留时间一致 而且 免疫斑点法结果都呈阳性 2 22 2 检查检查 注射用重组人促卵泡激素申报临床研究资料 No 13 长春金赛药业有限责任公司 17 2 2 1 外观 随机抽取三批重组人促卵泡激素成品观察