牙本质生物活性材料的相关性能及对牙髓干细胞周期及形态的影响

牙本质生物活性材料的相关性能及对牙髓干细胞周期及形牙本质生物活性材料的相关性能及对牙髓干细胞周期及形 态的影响态的影响 基金项目西安交通大学基本科研业务费资助 xjj2018166 陕西 省卫生计生科研基金项目 xxD017 作者简介王方 女 1985 08 生 博士 主治医师 E mailxjtuff 126 2019 05 19牙本质生物活性材料的相关性能及 对牙髓干细胞周期及形态的影响王方1 2 席爽1 2 逯宜1 2 1西安交通大学口腔医院 陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室 西安710004 2西安交通大学口腔医院口腔修复科 通讯作者 E mailxjtuff 126 摘要目的探讨经冷冻干燥处理的牙本质生物活 性材料 FD 的生物 力学性能以及该材料对牙髓干细胞 DPSCs 细胞周期及形态特征的影响 方法制备FD 检测FD 未冻干处理牙本质 D 羟基磷灰石 磷酸 三钙 HA 三组材料的挠曲强度及弹性模量 HE法观察材料的组织 结构 ELISA法检测材料 型胶原 COL 1 的释放量 将DPSCs分别培养于FD D HA及玻片四组材料表面 流式细胞术检 测材料表面DPSCs周期 免疫荧光检测材料表面DPSCs的骨架特征 结果挠曲强度D组为 194 1 24 3 MPa FD组为 166 1 57 5 M Pa HA组为 6 2 0 2 MPa 弹性模量D组为 5 8 2 1 GPa FD 组为 4 7 1 5 GPa HA组为 0 05 0 01 GPa FD组和D组的挠曲强度及挠曲弹性模量差异无统计学意义 P 0 05 而HA组的平均值显著低于其他两组 且差异具有统计学意义 P 0 01 组织学结果显示 冻干处理后牙本质小管形态较完整 FD组 D组二 者COL 1释放差异无统计学意义 P 0 05 FD组与D组DPSCs细胞周期分 布中各相细胞百分率无明显差异 HA表面DPSCs活性最低 荧光染色 显示两个牙本质组表面DPSCs细胞骨架结构优于HA组及盖玻片 MEM组 结论经冷冻干燥处理的牙本质生物活性材料具有与未冻干处理牙本 质相似的力学性能和组织结构 对DPSCs周期分布及细胞骨架结构有 积极作用 关键词牙本质 生物活性材料 牙髓干细胞 细胞外基质 细胞骨 架R318 08文献标志码A1007 6611 2019 09 1299 07DOI10 13753 j issn 1007 6611 2019 09 0 22Properties ofbioactive dentinmatrix andits effect on cell cycle and morphology ofdental pulpstem cellsWANGFang1 2 XI Shuang1 2 LU Yi1 2 1Key Laboratoryof ShaanxiProvince forCraniofacial PrecisionMedicine Research College ofStomatology Xi an JiaotongUniversity Xi an710004 China 2Department ofProthodontics College ofStomatology Xi an JiaotongUniversity Corresponding author E mailxjtuff 126 AbstractObjective Toexplore theproperties of freeze dried dentinbioactive materials FD and theireffects on cellcycleandmor phology ofdental pulpstem cells DPSCs Methods Theflexural strength and elasticmodulus ofFD untreated dentin D andhydroxyapatite tricalcium phosphate HA were measured The structureof thematerials wasobserved byHE staining The releaseoftype collagen COL1 was detected by ELISA DPSCs werecultured withprepared FD D HA andslides respectively The cellperiodicdistribution of DPSCs culturedon thesurface ofmaterials mentionedabove wasdetectedbyflow cytometry The skeletonchar acteristics of DPSCs culturedon thesurface ofmaterials weredetected infour groupsby confocalmicroscopy Results Flexuralstrengthwas 194 1 24 3 MPa in D group 166 1 57 5 MPa in FD group and 6 2 0 2 MPa in HA group Flexural moduluswas 5 8 2 1 GPa ininD group 4 7 1 5 GPa in FD group and 0 05 0 01 GPa in HA group There wasno significantdifference in flexural strengthandflexural modulusbetween FD group and D group P 0 05 but theflexuralstrengthand flexuralmoduluswere higherinFD group and Dgroupthan thoseinHAgroup P 0 01 Histological resultsshowed thatsamples inFDgroup andDgrouppreserved theintact dentintubule morphology There wasno significantdifference inCOL1release ratebetween FDgroup andDgroup P 0 05 The cellcycle resultsshowed thatthere wasno significantdifferenceinthe percentageof cellphasesbetween FD group andDgroup and theDPSCs activityinHAgroup was the lowest Fluorescence stainingshowed thatthe structureofactin inDPSCs of the two dentin groups FDgroupandDgroup was betterthan thatof HAgroupand coverslips MEM group Conclusion FDhas similarmechanical propertiesand microstructureto untreateddentin and hasa positiveeffecton the periodicdis tribution andcytoskeletal structureofDPSCs Key wordsdentin bioactive materials dental pulpstem cells extracellular matrix cytoskeleton龋坏 牙周炎 创伤等原因导致的牙列缺损 或缺失会损害患者咀嚼功能及美观 并降低患者生活质量 1 2 同其他组织工程一样 支架材料在牙本质再生过程中提供新组织生 成的物理及生化支 9921 山西医科大学学报 2019年9月 第50卷 第9期万方数据持 3 4 组织工程材料对牙再生的意义非凡 5 现有人造成牙相关支架材料缺乏成牙诱导因素 包括各种化学因子 及材料表面微结构的诱导 导致很难再生出满足临床需求的牙本质 组织 牙本质中的生物活性物质是经成牙本质细胞分泌并储存在牙本质结 构中 成牙本质细胞外的理化微环境对诱导牙源性细胞的牙再生能 力具有重要意义 生物体自身的细胞外基质及所处的微环境对生物体的细胞行为具有 重要的诱导作用 在牙组织工程中 牙本质基质富含成牙相关生物活性因子和适宜牙 源性细胞生长的微结构 可以为多种牙源性细胞提供良好的成牙诱 导微环境 促进牙源性细胞发挥功能 6 大量的新鲜离体牙可为制备牙本质基质提供丰富的 7 如何有效保存和利用牙本质基质的生物活性物质和结构为牙组织工 程提供理想的支架材料是牙组织工程的热点问题之一 有研究显示 乙二胺四乙酸 EDTA 表面脱矿处理能够使胶原纤维 暴露并且可以改善牙本质的渗透性 增加牙本质生物活性物质的释 放 经EDTA处理的牙体组织可释放成牙活性物质 营造良好的诱导微环 境 8 10 经过冷冻干燥处理的材料在密封处理后能在20 左右或4 长期储存 经冷冻干燥处理 材料可以维持冻干处理前的形态 构造及性质 方便储藏运输 具有广阔的前景 为了提高生物产品的长期稳定性 冷冻干燥同种异体牙本质粉作为 骨再生材料已成功应用于牙周骨缺损患者的临床治疗 11 本研究探讨了冻干牙本质支架材料 FD 相关性能及其对牙髓干细 胞 DPSCs 细胞活性及形态的影响 初步为牙本质基质支架材料的 临床应用转化奠定基础 1材料和方法1 1材料人未经处理的新鲜拔除牙 西安交通大学口腔 医院 羟基磷灰石 磷酸三钙支架材料 HA 四川大学 胎牛 血清 MEM培养液 Gibco 美国 谷氨酰胺 Gibco 美国 罗丹明 鬼笔环肽 Sigma USA DAPI Sigma 美国 苏木精 伊红 Sigma USA Collagen typeI ELISAkit 上海巧伊 中国 propidium iodide PI Sigma USA 真空冷冻干燥机 Osterode Harz 德国 酶标仪 BioTek USA 激光共聚焦显微镜 Olympus 日本 Matlab软件 MathWork s USA EZTest CE万能材料实验机 SHIMADZU Japan 1 2FD的制备将人未经处理的新鲜拔除牙牙齿在 80 中保存3个月 以上 刮除牙周组织及牙髓组织后 将牙体组织置入超声清洗机中 超声震荡清洗5min 将清洁后的牙体组织表面采用EDTA梯度脱矿处 理 80 预冻2h 将预冻完成的牙体组织置于真空冷冻干燥机内 真空度0 06mbar 冷井温度 54 置物仓 30 的条件下 冷 冻干燥72h 辐照灭菌后可长期储存 用于后续力学及细胞学实验 见图1 A 新鲜拔除牙 B 冷冻干燥处理后牙体组织图1新鲜拔除牙冷冻干燥 处理前后对比图Figure1Tooth beforeand afterlow temperaturestorage andfreezedrying treatment1 3挠曲强度检测人牙本质组织体积较小 测量材料挠曲 强度的通用配件无法用于测定小体积的人牙本质样本 为此 本研究特制了检测人牙本质的三点弯曲配件 用来检测牙本 质的挠曲强度 该配件由上部配件及下部配件相对组成 上部配件为单个金属压头 下部配件为两个间隔5 5mm的金属压头组成 上部压头位于两个下 部压头的中央 下部压头的上端为弧形 在测量过程中可起到集中压力的作用 见 图2 测量前 将牙本质小柱垂直搭在两个下部配件压头上 放置时 尽 量使两个压头外侧的牙本质小柱长度相等 测量时 上部配件以1mm min的速度缓缓下降 直至接触牙本质小柱 将挠度强度测试数据输入Matlab软件 并制作冻干牙本质 FD 未处理牙本质 D 及羟基磷灰石 磷酸三钙 HA 三组的应力 应变曲线 1 4材料结构的组织学检测对采用1 2方法制备的冻干牙本质生物活 性材料 FD 和未冻干处理牙本质 D 两组材料进行组 0031 J ShanxiMed Univ Sep2019 Vol50No9万方数据图2挠曲强度检测示意及定制配 件 左下图 Figure2Flexural strengthtest andcostumized fittingsshownbelow left织学染色处理 对获得的组织学切片筛选各组材料不同角度的 牙本质小管剖面的差异进一步观察 1 5胶原释放能力检测采用ELISA法测定FD 未处理牙本质 D HA 中 型胶原 COL 1 的释放能力 将FD与未处理牙本质 D 置入液氮 经液氮冷却 材料的脆性增加 将研磨后获得的粉样材料等量分装 将HA粉末状按相同质量分装 三组粉末灭菌储存 每组材料按粉液 MEM培养液 比2g 10ml的比例配制 不加材料粉末的 MEM培养液为对照组 将加入 MEM培养液的FD组 D组 HA组和 MEM组置入孵箱 分别在1 2 3 4 5 6 7d取经过滤的上清液 按照ELISA检测说明书进行检测 采用ELISA法测定两个牙本质组及HA组材料的吸光度 450nm波长 并绘制标准曲线 计算样本数值 1 6人牙髓干细胞 DPSCs 的获取及培养用灭菌高速牙科手机沿牙 体长轴的方向磨一道长沟 将灭菌小凿抵住长沟 用力凿开牙体组 织 拔髓针拔髓 采用组织块法结合酶消化法将获得的牙髓细胞及 组织置于含15 FBS的 MEM中培养 1 7材料表面DPSCs细胞骨架形态检测采用细胞骨架免疫荧光染色法 检测各组材料 FD D HA 玻片 对实验细胞骨架形态的影响 DPSCs在四组材料表面培养17h 进行固定 漂洗 Triton X 100破膜 PBS漂洗 1 BSA封闭1h PBS漂洗 37 下phalloidi n rhodamine避光孵化1h PBS漂洗 DAPI复染5min PBS漂洗 封片后 观察细胞骨架蛋白的特点 1 8不同材料对DPSCs细胞周期的影响将DPSCs分别接种于FD D HA 及玻片材料 分别置入含15 FBS的 MEM培养液 培养3d后 胰蛋白酶分别消化各组材料表面的DPSCs 经碘化丙啶染 色 采用流式细胞仪分析材料表面DPSCs的细胞周期分布 1 9统计学分析SPSS18 0分析各组实验数据 计量数据以x s表示 采用Student st检验 one way ANOVA与Student Newman Keuls posthoc检验进行组间比较 检验水准采用 0 05及 0 01 2结果2 1挠曲强度检测结果应力 应变曲线显示 D组的断裂应力略 大于FD组 远大于HA组 在同一应变值下 D组加载应力高于FD组 D组挠曲强度为 194 1 24 3 MPa FD组挠曲强度为 166 1 57 5 MPa HA组挠曲强度为 6 2 0 2 MPa 弹性模量D组为 5 8 2 1 GPa FD组为 4 7 1 5 GPa HA组为 0 05 0 01 GPa 从挠曲强度实验结果可以看出 FD组的挠曲强度及弹性模量较D组略 低 但差异无统计学意义 而HA组显著低于其他两组 且差异有统 计学意义 P 0 01 见图3 FD冻干牙本质 D未处理牙本质 HA羟基磷灰石 磷酸三钙 与HA组 比较 P 0 01图3三组材料的力学性能检测Figure3Mechanical propertiestesting ofmaterials inthree groups 1031 山西医科大学学报 2019年9月 第50卷第9期万方 数据2 2处理前后不同剖面牙体组织学检测结果不同角度方向的FD组 与未处理牙本质组 D组 材料的HE染色结果显示 FD组与D组牙本 质小管结构清晰 冻干处理未明显改变牙本质小管的组织结构 见 图4 图4FD与D组牙本质小管的HE染色结果Figure4HE stainingresults ofFD andD2 3胶原释放能力检测结果两个牙本质组液体能通过ELISA法检 测出COL1的存在 而HA组和 MEM组均无 型胶原检出 COL1在各牙本质组的含量除第5天两组具有统计学差异 其余时间冷 冻干燥处理对牙本质的胶原释放能力差异无统计学意义 见图5 与D组比较 P 0 05图5两个牙本质组的 型胶原检测吸光度值Fig ure5Type collagen detectionvalues intwodentingroups2 4细胞周期检测结果流式细胞术测定FD D HA 及玻片表面DPSCs的细胞周期分布特点为S G2 M相的细胞百分比最低 组和最高组分别为HA组 MEM组 两个牙本质组S G2 M相的细胞百分比相似 差异无统计学意 义 见图6 2 5各组材料表面DPSCs的肌动蛋白荧光检测结果细胞肌动蛋白荧光 强度和结构可反应细胞骨架的张力 范围及细胞和支架材料的关系 两个牙本质组肌动蛋白荧光粗大清晰 密集 且DPSCs间的肌动蛋白 荧光可见重叠区域 而HA组及玻片组的牙髓干细胞肌动蛋白荧光不 清晰 强度较弱 细胞间的交通也较欠缺 见图7 3讨论牙本质具有合适的机械性能并含有丰富的成牙相关活性物质 是一种适合牙再生的组织工程生物支架材料 有明确证据显示脱矿牙本质材料可用于牙再生 12 然而牙本质生物材料保存方法的不足阻碍了这些研究成果的临床转 化 冷冻干燥能够延长生物制品储存的长期稳定性 保存材料原本的理 化性能并具有降低免疫原性的作用 结合可接受的处理费用使得冷 冻干燥技术能够用于牙本质基质生物材料的制备中 实验结果显示 本研究制备的FD具有与未处理牙本质类似的理化性 能 且对DPSCs的细胞活性及骨架蛋白结构具有积极作用 牙本质的力学性能优越 能够在一定程度上抵御和降低牙合力对牙 齿的冲击 许多牙科充填材料及全瓷材料的研制均希望达到牙本质相似的力学 性能 许多细胞支架材料的开发也着重于与牙本质组 2031 J ShanxiMed Univ Sep2019 Vol50No9万方数据图6FD D HA及 MEM组DPSCs各相细胞分布图Figure6Cell distribution ofDPSCsinFD D HA and MEM groups图7冻干牙本质活性生物材料 FD 未冻干牙本质 D 羟基磷灰石 磷酸三钙 HA 盖玻片 cover slip 对牙髓干细胞肌动蛋白免疫荧光强度及结构的影响 scale bar 100 m Figure7Effects offreeze dried dentinbioactive materials FD dentin D hydroxyapatite tricalcium phos phate HA andcoverslipontheimmunofluorescence intensityand structureof actinin dentalpulpstem cells scale bar 100 m 3031 山西医科大学学报 2019年9月 第50卷第9 期万方数据织有相似的性能 骨与牙本质是人体内的主要硬组织 二者在细胞组成 组织结构 功能行使 组织上差异显著 本研究中用于制备冻干牙本质的流程在冻干骨制备流程上经过改良 制备而成的冻干牙本质具有良好的挠曲强度及弹性模量 这对细 胞层面的组织再生及宏观层面的牙齿功能行使均有积极的作用 材料的力学性能 构成 化学成分 与细胞接触部分的结构特征等 等因素均会影响细胞与材料的初步接触 黏附及在材料表面及内部 的生长 13 本研究中各组材料与DPSCs相互作用的体外研究显示FD组与D组表面D PSCs细胞骨架结构更为清晰 骨架蛋白荧光强度高 细胞间交通明 显 表明牙本质的表面形态及储藏的多种成牙相关蛋白能够促进牙 髓干细胞的生物学行为 细胞表面及内部存在大量感受外部环境的相关结构 细胞能够根据 捕获的信息对材料做出进一步反应 即地形学 topogra phies 14 类似地 动力传导 mechanotransduc tion 理论认为 生物体细胞所处环境中众多因素 如材料结构 细胞受力情况等可经细胞内在处理后转变为内在的化学信息 这些 化学信息将进一步影响细胞的增殖 分化及黏附等相关功能 15 DPSCs在不同支架材料表面的长期生长分化模式可能与细胞和不同材 料最初的接触模式有关 有研究显示牙髓干细胞 材料第一阶段的相互作用 包括细胞接触 黏附 伸展 会影响第二阶段DPSCs向成牙本质细胞的分化 16 支架材料的结构及形态会影响接种或归巢于其表面及内部的细胞行 为 细胞外微环境同样会对细胞次级结构产生作用 如细胞黏附分子受 体 构成成分 迁移轨迹 超细胞特征等 即材料对细胞的 接触 诱导 关于细胞与不同表面及内部结构的材料研究已相对深入 并建立多 个有关 接触诱导 的理论 17 例如研究将硅胶材料处理成具有小管状的结构 在其上接种牙源性 细胞 同时将牙源性细胞接种于光滑的硅胶材料表面 两组细胞显 示出截然不同的胶原分泌能力及生物学行为小管状硅胶表面的牙源 性细胞能够进入小管 与生理情况更为相似 18 本研究挠曲强度检测结果表明 结合EDTA脱矿处理的冷冻干燥牙本 质基质制备技术能够保持与天然牙本质相似的机械性能 组织学染 色结果表明冻干处理前后牙本质的组织学结构未发生明显改变 而 良好的机械力学性能和适宜DPSCs生长的微结构均有利于提高组织工 程牙再生的成功率 COL1释放检测结果及冷冻干燥原理提示FD保留了牙本质中的生物活 性物质 而细胞在冻干前后两组牙本质支架表面及在HA和玻片表面 骨架蛋白形态的反差印证了材料结构和生物活性物质的保留对细胞 产生的巨大影响 本研究研制的牙本质生物活性材料为组织工程牙再生提供具有应用 前景的新型支架 另一方面 冻干技术使材料便于保存和运输 为组织工程牙库的建 立提供支持 其制备成本使牙库的日常商业应用成为可能 为牙组 织工程的临床转化提供依据 参考文献 1 Dave JR Tomar GB Dental tissue derived mesenchymalstemcellsapplications intissue engineering J Crit RevBiomedEng 2018 46 5 429 468 2 Dong Q Wang Y Mohabatpour F et al Dental pulpstemcellsisolation characterization expansion and odontoblastdifferentiationfor tissue engineering J Methods MolBiol 2019 192291 101 3 Tabatabaei FS Tatari S Samadi R et al Different methodsofdentin processingfor applicationin boissue engineeringAsystematic review J J BiomedMater ResA xx 104 10 2616 2627 4 Discher DE Mooney DJ Zandstra PW Growth factors matri ces and forcesbine andcontrol stemcells J Science xx 324 5935 1673 1677 5 Song JS Takimoto K Jeon M et al Decellularized humandentalpulp asa scaffold for regenerativeendodontics J J DentRes xx 96 6 640 646 6 Yin Y Li X He XT et al Leveraging stemcell homingfortherapeutic regeneration J J DentRes xx 96 6 601 609 7 Guo W Gong K Shi H et al Dental folliclecells andtreateddentin matrixscaffoldfortissueengineeringthe toothroot J Biomaterials xx 33 5 1291 1302 8 Guo W He Y Zhang X et al The useof dentinmatrix scaffoldanddental folliclecells fordentin regeneration J Biomateri als xx 30 35 6708 6723 9 Smith AJ Duncan HF Diogenes A et al Exploiting thebioac tive properties ofthedentin pulp plexin regenerativeendo dontics J J Endod xx 42 1 47 56 10 Widbiller M Eidt A Hiller KA et al Ultrasonic activation ofirrigants increasesgrowth factorrelease fromhuman dentine J Clin OralInvestig xx 21 3 879 888 11 Yoshida T Itoh T Saitoh T et al Histopathological studyof theuseoffreeze dried allogenicdentin powderand truebone ceramicasapical barriermaterials J J Endod 1998 24 9 581 586 4031 J ShanxiMed Univ Sep2019 Vol50No9万方数据基金项目湖北省自然科学基金资 助项目 WJxxMB278 作者简介李儒佑 男 1974 09生 博士 副 主任医师 E mail3219475665 qq 2019 05 15重组干扰素 对变应性鼻炎大鼠 鼻黏膜中NLRP3炎症小体活化的影响李儒佑 冯六连 柯正华 周 朕 黄永军 王钢胜 鄂东医疗集团黄石市中心医院 湖北理工学 院附属医院呼吸内科 黄石435000 通讯作者 E mail995491185 qq 摘要目的探讨重组干扰素 IFN 对变应性鼻炎 AR 大鼠鼻黏膜中NLRP3炎症小体活化的影响 方法8周龄雄性SD大鼠30只 随机分为对照组 AR组和IFN 组 每组10只 卵清蛋白 OVA 法制备大鼠AR模型 AR组和IFN 组大鼠从激发第1天开始 在给予OVA激发前30min 分别用PBS和I FN 滴鼻 50 l 侧 1次 d 连续激发20d 末次激发后30min内 对大鼠行为学评分 各组大鼠 于评价结束后 RT PCR检测大鼠鼻黏膜中NLRP 3 ASC和Caspase 1mRNA表达 Westernblot检测大鼠鼻黏膜中NLRP 3 ASC pro Caspase 1和Caspase 1P20蛋白表达 ELISA法检测大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL 1 IL 6和IL 8水平及血清中OVA sIgE浓度 结果成功构建了AR大鼠模型 与AR组比较 重组IFN 滴鼻可降低AR大鼠行为学评分 P 0 01 AR组大鼠鼻黏膜中NL RP 3 ASC和Caspase 1mRNA相对表达量均高于对照组 P 0 05 NLRP 3 ASC和Caspase 1P20蛋白相对表达量均高于对照组 而pro Caspase 1蛋白相对表达量低于对照组 P 0 05 重组IFN 滴鼻大鼠鼻黏膜中NLRP 3 ASC和Caspase 1mRNA表达量均明显低于AR组 P 0 05 NLRP 3 ASC Caspase 1和Caspase 1P20蛋白相对表达量均低于AR组 而Pro Caspase 1蛋白相对表达量高于AR组 P 0 05 AR组大鼠双侧鼻腔灌洗液 中IL 1 IL 6和IL 8水平及血清中OVA sIgE浓度均高于对照组 P 0 05 重组IFN 滴鼻大鼠双侧鼻腔灌洗液中IL 1 IL 6和IL 8水平及血清中OVA sIgE浓度均明显低于AR组 P 0 05 结论重组IFN 滴鼻可影响NLRP3炎症小体介导的炎症反应 从而减轻AR大鼠变应 性鼻炎症状 关键词变应性鼻炎 干扰素 NLRP3炎症小体 大鼠R765 21文献 标志码A1007 6611 2019 09 1305 05DOI10 13753 j issn 1007 6611 2019 09 0 23Effect ofrebinant interferon gamma on activationof NLRP3inflammasome innasal mucosaof ratswith allergicrhinitisLI Ruyou FENG Liulian KE Zhenghua ZHOU Zhen HUANG Yongjun WANG Gangsheng Department ofRespiratory Medicine Edong MedicalGroup HuangshiCentral Hospital Affiliated Hospitalof HubeiPolytechnic University Huangshi435000 China Corre sponding author E mail995491185 qq AbstractObjective Toinvestigate theeffect ofIFN onactivationofNLRP3inflammasome innasal mucosaof ratswith allergicrhinitis AR Methods Thirtymale SDrats aged8weeks wererandomly dividedinto controlgroup AR groupand IFN group with10rats ineach group Rat ARmodel wasprepared using