AIDS实验室诊断

艾滋病的特异性实验室检查及临床意义,第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心康文臻,历史回顾,1981 卡波济肉瘤（kaposi sarcoma）病例1982 正式提出了AIDS或艾滋病的概念1983年5月“Science”同时发表了法国巴斯德研究所的蒙泰尼埃(Luc Montagnier)和美国国立癌症研究所的盖洛(Robert Gallo)的论文 。1986年 统一命名,HIV病原学,HIV属逆转录病毒科慢病毒属，颗粒呈球形，直径90 nm130nm。病毒的核心呈中空锥形，由两个单链的RNA 分子组成，中间有一个柱状核心，外面包一层球形膜，由宿主细胞膜和病毒特异性糖蛋白组成。,HIV有9个基因控制着结构和调节的功能,3个结构基因(gag、env 、pol）控制病毒结构成分蛋白质的组成； gag基因编码病毒的核心蛋白；pol基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）；env基因所编码病毒包膜蛋白，是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。6个调节基因tat, vif, vpr, vpx (vpu), nef, rev控制病毒感染细胞、整合进宿主细胞遗传物质，以及复制新病毒的能力。调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制。,Human Immunodeficiency Virus (HIV),Host cellprotein,Lipid layer,Nucleocapsid(p17),Reverse transcriptase,Ribonucleic protein(p24),RNA with protein surround (p7/p9),Spike of envelope glycoprotein (gp120),Trans-membranous glycoprotein(gp41),100-150 nm,HIV-1结构蛋白,Gag基因P17（基质蛋白）P 6（出芽时作用）P24（衣壳结构蛋白）P 9（核衣壳蛋白）Pol基因P10（PR）P50（RT）P15（RN）P32（IN）Env基因gp120（膜表面蛋白）gp41（穿膜蛋白）,Pr 160,HIV-1结构基因,Gag基因P 16P 26Pol基因P 68P 53P 54Env基因gp 105gp 36,Pr 68,Pr 140,HIV-1调节蛋白,基因HIV-1功能TatP16/p14增强病毒复制1000倍RevP19与表达结构蛋白核新一代病毒颗粒有关VpuP16增强病毒颗粒释放VifP23促进病毒成熟VprP10-15病毒产率有关(?)NefP25病毒颗粒传染性 (?),两型HIV毒株比较,HIV-1HIV-2分布全球性地区性传播模式相同相同造成OI一样一样导致AIDS一样一样传染性+ +母婴传播+ +发展AIDS短较长引起临床症状+ +感染模式多少，与HIV-1同时感染两者交叉40-60%HAART佳稍差，NNRTI差,诊断原则,艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起，以严重免疫缺陷为主要临床特征的传染病，其感染各期的确诊必须根据流行病学接触史、临床表现和实验室检查结果综合分析，慎重诊断。无论处于哪一期的HIV感染，必须要有抗HIV抗体阳性或HIV抗原阳性的实验室检测依据。HIV实验室检测方法包括：病毒分离培养、抗体检测、抗原检测、病毒核酸检测、病毒载量检测。,艾滋病的特异性实验室检查,HIV感染的检测 对病毒及其成分的检测 病毒感染后机体特异性和反应物（抗体、 特异性免疫细胞等）的测定，感染者及感染病毒状态的检查 病毒水平 生物学特性及作用 机体免疫系统状况,HIV感染的检测,目前作为诊断手段使用的检测主要包括 抗HIV病毒抗体检测 病毒培养 核酸检测 抗原检测,血清学检测,HIV感染的自然史,CD4细胞(cell/mm3）800400,急性感染期,无症状期,艾滋病前期和艾滋病期,CD4,病毒载量,抗HIV 的CTL,HIV抗体,在感染HIV-1后，患者血清中最先出现p24抗原，继之，各种HIV-1抗原可达到高峰；2-6周后，随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加，HIV-l抗原渐趋降低或检测不出。,HIV抗体检测,HIV感染后必须要以实验室检查为基础。我国现阶段HIV实验室检测主要为HIV抗体检测。HIV抗体检测需要经过初筛和确认试验。初筛试验可选择酶联免疫吸附试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、免疫荧光法（IF）、免疫酶法（IE）、乳胶凝集试验（LA）等。初筛试验结果阳性后，再做确认试验。常用的确认试验为蛋白印迹法（WB）。确认试验阳性时才能确定为HIV感染,HIV抗体初筛实验,初筛检测通常由取得资格的HIV-1抗体初筛实验室和或确认实验室中进行，HIV-1抗体确认和HIV-1抗体阳性报告必须由取得资格的确认实验室进行。初筛试验初筛试验用于检测HIV特异性抗体总量。使用的抗原分细胞内HIV抗原及细胞外HIV抗原。,血清HIV-1抗体检测,检测HIV抗体是常规使用的HIV病原学诊断方法。临床通用的是酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹法（WesternBlot）和目前开始推广的快速诊断法。感染HIV-1后，机体针对HIV-1基因编码的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原(如gpl60，gpl20，gp41，p66，p55，p51，p31，p24，p17等)的抗体。,HIV抗体初筛检测HIV,酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）明胶颗粒凝集实验（gelatine particle agglutination assay，PA）乳胶凝集实验（latex agglutination assay，LA）各种快速检测实验（rapid tests）放射免疫实验（radio immunoassay）,方法和原理,酶联免疫吸附试验(Ezyme linked immunosorbentassay，ELISA)简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术，其基本方法分三类：间接法、双抗原夹心法和抗体竞争法。,实验使用的抗原,第一代试剂：完整病毒的裂解主物 假阳性反应、制备和纯化比较困难、危险性大。第二代试剂：重组或合成多肽HIV抗原 敏感性和特异性均有所提高，更为安全、容易、重复性好。有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，由于缺乏合适的立体构象有可能使敏感性下降从而导致假阳性。第三代试剂：使用重组或合成多肽抗原 这种试剂可以检测针对HIV抗原的所有抗体亚型，不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。,初筛检测的阳性结果不是最终结论，样本经复检仍为阳性，应及时送实验室进行确认；初筛检测的宗旨是避免漏检敏感性高，必须为HIV-1/2混合型；交叉反应性或假阳性反应：如系统性红斑狼疮和风湿病者体内的自身抗体与HIV-1的某些抗原决定簇有交叉反应性还应注意假阳性，以及实验操作过程中的技术误差；不同厂家及同一厂家生产的不同批次试剂的敏感性和特异性可能存在一定差异，各实验室最好应用标准质控血清对新购试剂及在每次检测时进行质量控制和质量评价。,快速试剂,人类免疫缺陷病毒（HIV）1+2型抗体诊断试剂（胶体硒法） lnstant CHEKTM-HIV 1+2是金标快速诊断试剂,PA 定量试验,C 对照颗粒S 致敏颗粒M 阴性颗粒,HIV抗体确认实验,待血清初筛试验结果为阳性时，需再经确证试验检测，后者阳性时才能确定为HIV感染。根据卫生部规定，HIV-1抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的HIV抗体确认实验室出具才有法律效应。 最常用的HIV-1抗体确认实验方法是免疫印迹法（Wwstern Blot,WB）和条带免疫印迹法（Strip Immunoblot Assay, SIA或Linear Immunoblot Assay, LIA）,其中以WB法最常用。,HIV-1抗体免疫印迹实验,免疫印迹实验（westen blot,WB）是广泛用于许多传染病诊断的实验方法就HIV的病原学诊断而言，它是首选的用以确认HIV抗体的确认实验方法，用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原，WB的检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的“金标准”。能同时检测不同HIV-1抗原组分的抗体，因此能够鉴别或肯定初筛检测的结果。,条带免疫印迹法,工作原理和操作方法与WB实验基本相同，只是条膜上抗原来源和组成有所区别。检测时信噪比高，本地清晰，无潜在假阳性干扰，且可通过调整条膜上HIV抗原量，克服了WB实验中使用病毒裂解产物而可能产生的固相载体上某些重要抗原量不足的缺点。这类试剂特异性很高，但也可能由于病毒株在所合成抗原决定簇部位发生突变导致HIV抗体假阴性结果；另一个缺点是由于合成抗原不能糖基化，其立体构像与天然抗原分子有一定差异，在一定程度上可能影响了模拟真实HIV抗原检测抗体的能力。,HIV抗体WB实验的阳性判断标准,免疫荧光实验,免疫荧光（IFA）的原理。以固定于玻片上的感染细胞内的HIV作为抗原，与待检血清反应以后，加入荧光素标记的抗人免疫球蛋白，洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下观察结果，胞浆内出现特异性荧光，而对照孔没有特异性荧光，就可诊断为HIV抗体阳性。,IFA特点,IFA法经济、简便、快速，曾被FDA推荐用于WB不确定样品的诊断。需要昂贵的荧光显微镜要受过良好训练的技术人员、观察和解释结果易受主现因素的影响，不宜长期保存IFA不宜在一般的实验室开展的应用。,结果判定,诊断HIV抗体阴性一般认为应任何条带出现，但是世界卫生组织有微弱的P17带也可为报告阴性。有1个或几个带出现，但又不满足阳性标准的结果可以判断为不确定或可疑（indeterminant）。,对不确定结果的解释,HIV早期感染 在不同的WB条带中，P24、P31和P55比单独P17预示早期感染的价值高得多。非特异性反应 持续的不确定结果可能提示非特异性反应，如高球蛋白症、由于其他病原微生物感染导致在交叉反应的抗体等等有时AIDS病人也可以表现为持续的不确定结果，如在病程的晚期，可能丧失对P24抗原或其他抗原的反应性而表现为不确定结果 。,对不确定结果的处理方法,随访 随访时间为16个月不等 不同时间随访的标本最好用同种同一 个批号的试剂检测 如果6个月以后，带型消失或没有进展 阴性；出现了带型的进展，特别是出现了包 膜抗原的条带 早期HIV感染 病毒的分离培养、检测病毒的核酸和抗原。 接种了HIV疫苗的人也可能出现HIV抗体阳性。,假阳性血清学检测,一般人群，在美国发生率0.0006%原因最近预防接种（流感，HIV）高丙种蛋白血症（全身性红斑狼疮）一般人群WB不确定率2/100,000，医院EIA阳性标本中WB确定率10-15%。最多见一条P24。不确定条带出现与胶原脉管病、恶性肿瘤、非B型的HIV感染，HIV毒株感染，高危人群,假阴性血清学检测,指EIA+WB的假阴性原因急性感染后的抗体迟反应不同HIV毒株型发病晚期抗体消失窗口期：几周到6个月，与当地HIV流行率有关HIV亚型,新生儿HIV感染的特殊试验,婴儿HIV/AIDS病例 小于18个月的婴儿，抗HIV阳性抗体可能来自HIV感染的母亲。确认诊断需HIV培养、HIV PCR检测或HIV抗原（P24）中任何一项试验的阳性结果。,2003年全国HIV抗体诊断试剂临床质量评估,ELISA试剂（13种） 丽珠、生物梅里埃、万泰、MUREX、绿科、永华、金豪、科华、新创、普生、中山、华美、吉比爱快速试剂（7种） 科华、新创、PA、雅培、EY、艾康、万泰,2003年10月ELISA试剂临床评估结果,试剂名称 敏感性（%） 特异性（%） 功效率（%）丽珠 100 99.1 99.25生物梅里埃 99.21 98.73 98.83万泰 100 98.22 98.58MUREX 100 98.09 98.58绿科 100 97.96 98.33永华 99.70 97.12 97.83金豪 99.67 96.98 97.66科华 99.35 96.87 97.50新创 99.58 96.67 97.25普生 98.98 96.01 96.50中山 100 95.21 96.42华美 100 94.98 96.25吉比爱 100 94.82 95.67,快速试剂临床评估结果,试剂名称 敏感性（%） 功效率（%）科华(胶体金） 94.29 98.33新创(胶体金） 96.77 98.25PA（凝集法） 99.15 98.17雅培(胶体硒） 96.71 98.08EY (胶体金） 99.07 98.00艾康(胶体金） 91.48 96.17万泰(胶体金） 94.93 94.75,ELISA和PA对强阳性样品的滴度测定,所用ELISA试剂为生物梅里埃HIV 试剂盒, 其Cut off值为0.150,病毒检测,方法HIV抗原、HIV培养DNA PCR、RNA PCR意义正确性均小于血清学检测，用于解释不确定结果，无法进行的检测治疗指征、监视病情、监视疗效、新生儿感染、窗口期等HIV-1 DNA PCR：1-10 HIV 前病毒DNA拷贝,HIV抗原检测,在HIV感染的早期会出现一过性的抗原血症，此期间血浆中的病毒抗原可能被检测到大多数感染者在随后相当长的一段时间内测不到抗原在疾病晚期，随着免疫系统功能的丧失的病毒复制量的增加，部分患者可再次出现可检测到的抗原HIV病毒抗原中最重要的面分是P24抗原，几乎所有的抗原检测都是针对P24设计的。,检测方法多为ELISA法，其中间接法较为常用。抗原捕获ELISA原理较为简单，主要是在固相上包被抗P24抗体，以捕获样品中的抗原成分，再用酶标记的另一抗P24抗体与被捕获得抗原反应，通过对酶催化显色的强度测定判断结果。,抗原检测实验可进行定量或定性检测，定量检测与定性检测的不同之处在于在定量检测时需要使用试剂盒给定的标准品进行梯度稀释，从而根据稀释度的检测结果（吸光度值）绘出定量曲线，将待测样品的检测值勤带入此曲线，进行定量。定量检测值通常用来作为表示病毒水平的指标。,作为辅助诊断进行定性检测时，阳性结果通常需要进行中和实验的试剂通常由同一厂家供给，其原理是通过加入 中和试剂对标本进行前处理后瑞进行抗原检测，当处理后样品检测值下降到一定程度时（标准因试剂而异。常为50%）可认为检测结果阳性成立。,核酸检测,HIV病毒核酸RNA的检测对HIV感染细胞核酸上整合的HIV核酸逆转录片断（cDNA）的检测。,RNA测定,HIV病毒RNA主要存在于病毒颗粒内，其定量测定主要反映了病毒存在的水平。病毒RNA的测定方法通常以定量为主，部分实验在定量方法上通过改变具备定性性能。,目前国际上常用的HIV RNA测定方法,核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sepuence-based amplification, NASBA）技术，其代表为Organon Teknika生产的NASBA HIV-1 RNA QT和NucliSrns HIV-RNA Qtassay;逆转录PCR系统（RT-PCR）其代表为Roche Diagnostic System生产的AMPLICOR HIV-1 MONI-TOR assay;分支DNA信号放大系统（BDNA），代表为Byer公司（原生产商Chiron Disgnostics被其合并）生产的Quantiplex HIV RNA assay.Abbott Iaboratories生产的LCx HIURNA Quantitative assay（LCx HIV）属于连接酶链式反应，由于推出较晚，使用较少，本部分不做详细讨论。,核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amqlification, NASBA）,为Organori Teknika公司专利技术，早期产品为NASBA HIV-1 QT定量RNA测定方法，现已被最新版本的方法NucliSens HIV-RNA QT assay取代。方法分为普通敏感性度和超敏感度两种。NASBA技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系统内含有逆转录酶AMV-RT和T7-DNA多聚酶以在体外模拟逆转录病毒核酸体内复制过程。扩增后的产物使用NASBA QR电化学光（ECL）系统进行检测和定量，根据野生型病毒核酸测定值与其他3个内标物测定值的比较可得到野生型病毒的拷贝数。,HIV-RNA商业性病毒载量检测法,Amplicor MonitorTM RT-PCR RocheQuantiplexTM bDNA BayerNuclisensTM NASBA OrganonLCxTM RT-PCR Abbott,病毒载量测定的意义,预测预后开始抗-HIV治疗的指标监视病程评价药物疗效解决窗口期标本和婴幼儿诊断,不同VL检测方法,厂家 应用方法 可检测范围Roche RT-PCR 标准方法：400 （Reverse transcriptase- 750,000cps/ml polymerase chain rea- 超敏方法：50 ction/target) 75,000cps/ml Bayer bDNA 2.0版：500 （branched chain deoxy- 1,600,000cps/ml ribonucleic acid/signal) 3.0版：50 500,000cps/mlOrganon NASBA Nucleic acid se- (Nucleic acid amplifica- quence-based tion/target) amplification: 40015,000,000 cps/ml Nuclisens: 40 10,000,000cps/ml,DNA测定,聚合酶链反应（PCR）是检测特定DNA片段非常敏感的方法。在诊断主面，DNA检测通常作为辅助性检测手段，,PCR技术,是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法DNA模板加热变性后两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性Tap DNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸这种实验过程是在温度控制下进行的，一个变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。不断重复；理论上讲PCR扩增DNA产量是呈指数上升的。,DNA检测技术在HIV检测中的应用,非典型血清学反应有临床症状/流行病学指标情况下的血清学阴性样品新生儿感染时在对感染者/AIDS病人进行临床观察或预后、HIV分型和变异研究等方面，DNA检测可作为常规手段。,序列测定和分析,HIV一个显著特点是基因的高度变异性随着现代分子生物学的发展，序列测定成为解释变异的最准确的方法序列测定对艾滋病病毒的检测和研究起到不可替代的作用费用昂贵，不易普及,DNA序列测定技术有两种：,Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Cilbert DNA化学降解法随着现代科技、计算机技术的高速发展及多学科的渗透，测序手段出从手动、半自动发展到全自动。,序列测定在艾滋病领域中的应用,在基因变异方面的应用 在耐药株检测方面的应用,免疫学检查免疫缺陷,外周血淋巴细胞计数显著下降：如减少可作为HIV感染病情进展的标志之一(2000/mm3，1000-2000/mm3，1000mm3，如不能进行CD4计数，则可以此代替。CD4细胞计数：是衡量机体免疫功能的重要指标。美国已将CD4200/mm3作为艾滋病的一项指标。CD4/CD8比值1，是由于CD4细胞下降所致。,CD4淋巴细胞,正常值：5001,400/mm3 (95%可信限范围）影响因素： *白细胞计数，淋巴细胞百分比和CD4细胞 百分比 *季节和昼夜变异（中12:00L夜8:30) *急性感染，大手术，肾上腺素 *性别，年龄，心理因素，地区 *方法，标本，操作,T4细胞数量减少的机理?,HIV的大量持续产生，使T4细胞破坏增加所致？,感染的早期： 1:10,000晚期 1:40HIV 能够杀伤T细胞亚群的前体细胞 HIV还没有溶解细胞的病毒携带者也能发展为AIDS,T4 细胞减少的机制破坏增加?,1. HIV及其包膜蛋白直接损伤细胞膜,病毒出芽导致细胞被破坏,但合胞体不常见多数T4 细胞不是 HIV+可以感染HIV阴性细胞,未感染的CD4 细胞Gp120 阴性,细胞融合,CD4 细胞被破坏2.感染细胞-未感染细胞形成合胞体,被感染的CD4 细胞Gp120 阳性,T4 细胞减少的机制破坏增加?,合胞体不具有免疫应答功能,杀伤CD4细胞3. 细胞毒性T细胞介导的细胞毒作用,T4 细胞减少的机制破坏增加?,4. 游离的Gp120结合CD4 抗原，使没有感染的T4 细胞看着象感染细胞补体介导溶解可以解释未感染HIV的T4细胞的丢失,T4 细胞减少的机制破坏增加?,程序性细胞死亡（programmed cell death）：细胞凋亡是机体保持内环境稳定的一种生理性细胞自杀机制。 自身免疫机制：MHC类分子尤为HLA-DR和DQ与HIV-lap120及gp41蛋白质具有结构同源性，抗gp120和gp41的抗体与HLA分子有交叉反应 超抗原：HIV本身可能有一个作用像超抗原如致病微生物抗原在HIV的免疫致病中可能起重要作用。,T4细胞