HIV抗体检测技术

HIV抗体检测技术,艾滋病病毒的形态,HIV的逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性 ，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。,HIV颗粒,HIV生活周期,吸附穿入脱壳生物合成组装成熟和释放,HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合,HIV感染后的血清学改变,艾滋病诊断的特殊性,高度依赖实验室诊断HIV检测的严肃性： 保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题结果严格保密,诊断：确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。监测：了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。血液筛查：防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,HIV抗体检测目的,HIV抗体检测,行业标准:艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS298-2008技术规范:全国艾滋病检测技术规范（ 2009年修订版）,筛查试验初筛复检确证试验,HIV抗体检测程序,筛查试验,筛查试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。HIV抗体筛查样品血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液。,初筛试验对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。,复检试验对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,筛查方法酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验（CLIA）：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。快速检测（RT）及其它检测试验 (1)明胶颗粒凝集试验(PA) (2)斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验 (3)免疫层析试验,HIV抗体筛查试验,(1)酶联免疫吸附试验（ELISA）,可使用血液、唾液、尿液样品单纯HIV抗体检测试剂HIV抗原抗体联合检测试剂：同时检测血液中 HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体，加底物显色，用酶标仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,间接法检测抗体,双抗原夹心法检测抗体,ELISA法结果判断,临界值概念: 将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于1(S/CO1)为阳性（对间接法及双抗原夹心法）注意:不同厂家、不同方法临界值计算公式不同cutoff=NC+0.1 cutoff=NC*2.1,四代艾滋病酶联免疫试剂比较,第四代,病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 Ab,IgM / IgG 抗体HIV-1 / -2 / -Op24 抗原,病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1 / -2 / -Oanti-p24 抗体,method,间接,间接,夹心,夹心,酶联免疫吸附试验（ELISA）,优点：准确性高、价格低廉、 判断结果标准客观、 结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,(2)化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物，既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体。HIV抗原或抗体包被于固相载体，加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。,（3）快速检测（RT）及其它检测试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急 诊检测。不需专门设备,人员培训简单,一般可在1030分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,HIV快速检测试剂按原理不同，分为以下三类： 1 免疫渗滤试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状 固定在膜上。加待检样品后，阳性结果在膜上抗原部位显示出 有色斑点。有效试验质控点必须显色。 2 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状 固定在膜上，加待检样品后，阳性结果在膜上抗原部位显示出 有色条带。有效试验的质控带必须显色。 3 明胶颗粒凝集试验（PA）：将HIV抗原致敏明胶颗粒 作为载体，加待检样品后。当待检样品含有HIV抗体时，明胶颗 粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读结果。,（1）明胶颗粒凝集试验（PA）将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后保温（一般为室温）。当待检样品含有HIV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。,快速诊断试剂,PA法原理,PA法操作步骤,PA法,（2）斑点EIA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上,加血清样品。斑点EIA法用酶标记抗体，以后步骤同ELISA。斑点免疫胶体金（或胶体硒）用红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白标记，用渗滤法作为洗涤方法。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10 min以内，使用抗原量少。,快速诊断试剂,金标诊断试验原理,快速诊断试验,（3）免疫层析试验(金标法、硒标法)以硝酸纤维膜为载体。加样区：预包被胶体金-抗原/胶体金-protein A结合物测试区（T）：固定有重组HIV抗原，质控区：抗HIV单克隆抗体/抗-protein A抗体,快速诊断试剂,全血样品 加50ul样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15分钟内读取结果,硒标法操作步骤,病人条,质控条,快速诊断试验,优点:试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。不需专门设备和人员培训,一般可在1030分钟内得出结果。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。注意：一定要将试剂平衡至室温,快速诊断试剂,HIV抗体确认试验,确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法：免疫印迹试验(WB)条带免疫试验(LIATEK HIV)放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA) 国内常用的确认试验方法是WB。,HIV抗体确认实验结果,HIV核酸定性检测,规定了核酸检测、核酸序列测定的实验室条件、检测方法及结果判定标准 结果报告 ： HIV核酸检测阴性:只可报告本次实验结果阴性。 HIV核酸检测阳性:可作为诊断HIV感染的辅助指标，不单独用于HIV感染的诊断。严格的实验室管理制度（分区、仪器和材料的专用、单向流向、废弃物处理）,HIV RNA定量测定（病毒载量测定）,方法 常用的HIV RNA定量测定方法有逆转录PCR试验（RT-PCR）、核酸序列扩增试验（NASBA）、分支DNA杂交试验（bDNA）。,HIV核酸定量检测的意义,辅助诊断：当RNA测定出现较高拷贝数的阳性结果时（3，000c/ml），感染发生的可能性非常大。应综合其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。 早期诊断 ：HIV感染孕妇所生婴儿 、残余危险度 病程监控 ：确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案。 指导治疗方案及疗效判定 ：通常在治疗前后病毒水平降低0.5 log以上才被认为临床有效。 预测疾病进程,适用范围：HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断； HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。检测方法：通常是采用ELISA双抗体夹心法。,HIV P24抗原的检测,结果报告和解释,HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认，若阳性标本的OD值比中和反应前减少50%以上，才确定为HIV P24抗原结果阳性。HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染窗口期的辅助诊断依据，不能据此确诊。HIV-1P24抗原检测的敏感性为3090，低于病毒载量测定。HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。,HIV抗体筛查检测流程图,筛查试验阳性反应样品,HIV抗体确证检测流程图,HIV抗体检测的要点1、根据目的选择检测方法及检测策略。2、严格遵守实验室SOP。3、筛查试验阳性，须作确证实验。4、筛查试验阴性，不应做确证实验。5、筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。,HIV 抗体检测不能用来