细胞凋亡蛋白的研究进展.docx

【摘要】细胞凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一。细胞凋亡是个体发育过程中由一系列蛋白调控的细胞主动死亡过程，在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育具有重要作用。它在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要意义。其中bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白都是重要的凋亡调节因子，在细胞凋亡中相互联系，相互作用，从而调控细胞凋亡本文探讨了bcl-2家族、caspase家族、p53蛋白、survivin蛋白对细胞凋亡的调控机制。【关键词】 细胞凋亡、 bcl一2家族、caspase家族、p53 蛋白、survivin蛋白引 言细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是多蛋白严格控制的过程，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了较为深入的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列蛋白的激活、表达以及调控等的作用。其中caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白和p53蛋白、survivin等在凋亡的信号转导中扮演着重要角色。一、caspase家族蛋白1.1 caspase家族蛋白介绍caspase是半胱氨酸基天冬氨酸一特异性蛋白酶(cystei-nyl aspartate specific proteinase)即半胱氨酸天冬氨酸酶的缩写。Caspase半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族，也称为ICE/CED-3家族， 是美丽线虫(Caenorhabditis elegans)死亡基因CED-3的同源物。这类蛋白酶与细胞凋亡形态学特征变化(如细胞膜空泡形成、核膜破裂、染色质聚集和边聚及DNA断裂等)以及一些生化改变关系密切。它们是一组存在于胞浆中的半胱氨酸蛋白酶，其共同特点是特异性断开天冬氨酸残基后的肽键。到目前为止，在小鼠和人类中，已经发现caspase家族至少有14个成员。细胞中合成的caspase以无活性的酶原状态存在，经活化后方能执行其功能。1.2 Caspase分类Caspase分为三大类：凋亡启动因子(apoptotic initiators)、凋亡执行因子(apoptotic executioners)和炎症介导因子(inflammatory mediators)，构成了级联放大效应。凋亡启动因子在级联反应的上游， 包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等,能在其它蛋白辅助下发生自我活化并识别和激活下游的Caspase。如Caspase-8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡。 凋亡执行因子在级联反应的下游，包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等， 作用于其特异性底物并导致细胞凋亡。 如Caspase-3，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志。 炎症介导因子包括Caspase-l、Caspase-4、Caspase-5和Caspase-1l,介导炎症反应并在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。1.3、类2UNELmatic stress )222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222Caspase的激活机制caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，caspase分子各异，但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N一端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N一端前肽，然后在大小亚基之间切割释放大小亚基，由大亚基和小亚基组成异源二聚体，再由两个二聚体形成有活性的四聚体。去除N一端前肽是caspase的活化的第一步，但是caspase-9的活化不需要去除N一端前肽caspase活化基本有两种机制，即同源活化和异源活化，这两种活化方式密切相关，一般来说后者是前者的结果，发生同源活化的caspase又被称为启动caspase，包括caspase-8，-10，-9，诱导凋亡后，起始caspase通过adaptor被募集到特定的起始活化复合体，形成同源二聚体构像改变，导致同源分子之间的酶切而自身活化，通常caspase-8，10，2介导死亡受体通路的细胞凋亡，分别被募集到Fas和TNFRl死亡受体复合物，而caspase-9参与线粒体通路的细胞凋亡，则被募集到Cyt cd ATPApaf-1组成的凋亡体，再激活caspase-3、6、7，最终导致细胞凋亡。1.4、Caspase与凋亡相关疾病的联系与肿瘤的联系：大量资料显示，在许多肿瘤细胞的凋亡中发现有Caspase的活化。 目前也已经发现一系列新的与Caspase有关的诱导凋亡的方法来治疗肿瘤，对大部分肿瘤有实际意义，并可望在恶性肿瘤的治疗方面取得新的突破。 与缺血-再灌注的联系：多数学者认为， 凋亡是心肌缺血及再灌注细胞死亡的一种主要形式。 研究表明， 在缺血再灌注试验中，Caspase也被证明参与了凋亡过程。与组织损伤的联系 :目前已证明Caspase与中枢神经损伤、 皮肤损伤及其它内脏损伤和炎症反应有关。最近又发现Caspase-9的激活,细胞色素C的释放可能是体内瘢痕疙瘩的成纤维细胞凋亡的基础。与PTSD的联系:线粒体细胞色素C可通过对凋亡信号的转导和放大作用调控细胞凋亡， 当细胞色素C释放到胞浆后， 可通过激活Caspase-3来介导细胞凋亡。二、Bcl-2家族蛋白2.1 Bcl- 2 家族蛋白结构及分类Bcl-2被认为是细胞凋亡蛋白家族中最重要的调控蛋白，和Bcl-2，Bax，Bad，Bak等共同组成了Bet-2蛋白家族，Bcl-2的功能受其蛋白产物Bax和Bel-xl蛋白调节。Bcl-2蛋白最早在人类滤泡样的细胞淋巴瘤中t(1418)染色易位的断裂点克隆发现。目前 Bcl- 2 家族成员已有超过 25 种被确认。根据其在细胞凋亡中的作用不同, Bcl- 2 家族分为两大类: 一类是抗凋亡蛋白, 主要包括Bcl- 2、Bcl- xL 和 Bcl- w等; 另一类是促凋亡蛋白, 主要包括 Bax、Bak、Bid、Bim 和 Bad 等。Bcl- 2 家族在其多肽链中至少含有 4 个 Bcl- 2 同源保守的螺旋结构域 BH1、BH2、BH3、BH4 中的一个, 多数含所有 4 个结构域; 而促凋亡蛋白中都一定含 BH3 结构域, 并且 BH3 是其促凋亡作用最重要的功能区。2.2 Bcl-2 蛋白家族调节细胞凋亡的机制近几年，关于Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径对细胞凋亡影响的研究，有了很大的进展。研究证明，线粒体外膜通透性的改变可引起细胞凋亡，而这种通透性的改变直接由Bcl-2家族蛋白控制。具体作用机制，主要被认为有以下两种：一是Bcl-2家族蛋白成员精确地改变线粒体膜的通透性；二是Bcl-2家族蛋白能够诱导线粒体通透性转变孔道的开放。正常生理状态下, Bax 以 Bax/Bcl - xL、Bax/Bcl- 2 异二聚体, 或以磷酸化单体样位于胞质内或松散地吸附在线粒体外膜上。实验表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白抗凋亡能力减弱了许多。已知Bcl-2不像其它典型的癌蛋白那样破坏细胞正常的增殖调控机制，而是通过阻止凋亡而促进细胞存活。线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能来抑制凋亡，线粒体膜上的Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位从而调控细胞凋亡。在细胞凋亡中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞内的氧化还原电位，来抑制细胞凋亡的Bcl-2能调节线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性。Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成分，它在较高的pH条件下形成离子通道，而Bax则能在较为广泛的pH范围内形成孔道。Bax能允许一些离子和小分子如细胞色素C等穿过线粒体膜，进入细胞质，从而引起细胞凋亡，而Bcl-2的作用正好相反，它能封闭Bax形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通透，从而保护细胞凋亡。Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不能发挥凋亡作用。Bcl-2除对凋亡的影响外，还能抑制细胞周期。三、P53蛋白3. 1 抑癌基因 P53与细胞凋亡抑癌基因 P53 编码产物与肿瘤的发生、发展相关，为肿瘤抑制基因，性质与 c - myc相仿，P53 可分为两种类型，一种是可诱导细胞发生凋亡的野生型，另一种是具有抑制凋亡能力的突变型。野生型 P53 是作为细胞周期 G1 的控制蛋白而发挥作用的，当DNA 损伤时，P53 编码的转录活化蛋白聚集在 DNA 损伤部位，使 DNA 受损细胞停止在G1 期，阻止 DNA 复制，从而使 DNA 得到修复，若 DNA 受损细胞修复失败，则 P53 介导细胞凋亡。如果 DNA 受损细胞逃脱了 P53 的监控，细胞就在遗传物质变异的基础上不断增殖而癌变。3.2 p53介导凋亡的机制p53是一类重要的肿瘤抑制因子，p53的异常表达会导致多种癌症。例如在70肺癌、30乳腺癌和5白血病细胞中都检测到了p53的突变。 正常生理情况下，p53维持在相对稳定的水平，当细胞遭受DNA损伤和氧化压力的诱导下机体通过抑制蛋白酶体的降解迅速增加p53的含量，进一步导致细胞阻滞或细胞凋亡。肿瘤抑制蛋白p53在维持蛋白组的完整性中起着重要的作用。p53作为一个转录因子对DNA损伤做出反应，并诱导下游蛋白如p21，Mdm2和Bax的表达，这些下游蛋白可调节细胞周期和凋亡。正常的p53在细胞里的功能有多种，但目前研究最多的有两种，一种是抑制细胞分裂，让其停留细胞周期的Gl期，另一种是使细胞凋亡。p53介导凋亡的机制可能是通过以下几点：在凋亡过程中线粒体膜失去完整性，接着细胞色素C释放入胞浆，引起caspase断裂激活。抗凋亡蛋白bcl-2和促凋亡蛋白bax可调节细胞色素C释放。Bax显示在它的促进子内有某些p53结合位点，它对DNA损伤的上调反应并增加p53。p53介导的细胞凋亡能被Bcl-2Bcl-x抑制。活性氧(ROS)是线粒体损伤和凋亡的有力的激活剂。许多蛋白能增加ROS的产生，因此氧化应激能被p53诱导。p53在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖过程中起着重要作用。它通过停止细胞生长和诱导细胞凋亡而发挥其肿瘤抑制者的功能。它是细胞生长的“监控器”，是细胞生长重要的负调节蛋白，在细胞受到射线或某些药物作用发生DNA损伤的情况下，p53蛋白能阻止细胞周期停滞在G1期，使细胞有足够的时间修复损伤，恢复正常状态，重新进入细胞周期。若损伤不能修复，它可启动细胞的程序性死亡过程引起细胞凋亡，从而保证有癌变倾向的细胞不再存活下去。四、Survivin蛋白4.1 Survivin蛋白的分子结构 凋亡抑制蛋白(IAP)是凋亡抑制蛋白家族之一，survivin是新近发现的该蛋白家族的最小成员，也是迄今发现最强的凋亡抑制因子，在凋亡和细胞周期的蛋白调控中发挥重要的作用。Survivin基因编码产生的蛋白由142个氨基酸组成。相对分子质量为16 500，它的结构在IAP家族中是非常独特的，与其他IAP成员结构的区别：哺乳动物的IAP同时具有包含23个相串联的含有半胱氨酸组氨酸的杆状病毒IAP重复序列(BIR)，而Survivin是迄今发现的IAP家族成员中唯一含单个BIR结构的蛋白。Survivin蛋白的BIR由Cys-Pro-Thr 3个氨基酸插入序列将其分成2个等分的模块。这一插入片段是Survivin特有的，其具体功能有待进一步研究。有研究发现，插入的苏氨酸(Thr)能被细胞周期依赖激酶Cdcz磷酸化，而Thr的磷酸化是维持Survivin活性的必要条件，并且Cdc2是已知激活Survivin的唯一激酶。Survivin羧1基末端含有一个长度65nm、由40个氨基酸组成的口螺族结构，缺乏IAP家族成员特有的环指结构与锌结构的结构域。激活后的Survivin通过羧基末端q螺结构与纺锤体的微管结合发挥抑凋亡作用，若此处突变，则丧失与微管结合能力而不能发挥抑凋亡功能。4.2 Survivin蛋白与细胞凋亡由于一身兼有抑制线粒体途径细胞凋亡和参与细胞有丝分裂的双重作用，并且还具有独特的肿瘤特异性，survivin日益受到重视。survivin是一个受p53调控的下游蛋白。若干数据显示p53能够抑制survivin的转录。Survivin可能主要通过两条途径来抑制细胞凋亡；一是通过直接抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性，阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；二是Survivin与细胞周期蛋白激酶CDK4、p34cdc2相互作用阻断凋亡信号转导通路。Survivin不仅具有抑制细胞凋亡作用，而且在调节细胞有丝分裂中有重要作用，如微管的聚合、卵裂沟的形成和胞质分裂。抑制细胞生存素表达可产生畸形纺锤体、多倍体、多核畸形等异常，细胞不能正常分裂，所以它是正常胚胎细胞有丝分裂和增殖的必要条件。在有丝分裂早期，Survivin与组成有丝分裂纺锤体的微管结合，如果Survivin微管之间的相互作用瓦解，会丧失抑制细胞凋亡的作用。在细胞周期的GzM期，生存素能对抗异常因素诱导的细胞凋亡，其过表达可使细胞逃逸亡关卡(checkpoint)，促进细胞的异常增殖。五、其他相关蛋白的简介5.1 FasFas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。5.2 myc在许多人类恶性肿瘤细胞中都发现有c-myc的过度表达，它能促进细胞增殖、抑制分化。 在凋亡细胞中c-myc也是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。5.3 ATMATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）是与DNA损伤检验有关的一个重要基因。最早发现于毛细血管扩张性共济失调症患者，人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。正常细胞经放射处理后，DNA损伤会激活修复机制，如DNA不能修复则诱导细胞凋亡。ATM是DNA损伤检验点的一个重要的蛋白激酶。5.4 Apaf-1Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用。Apaf-1含有3个不同的结构域：CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9；ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c的结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。结语：综上所述, 细胞凋亡发生的信号转导途径是多样的, 这些途径之间彼此间相互促进或制约, 形成了错综复杂的调控网络。目前, 细胞凋亡的发生机制尚不完全明确, 不同药物诱导细胞凋亡的途径不同,并且参与调节的蛋白也各不相同。因此, 深入研究细胞凋亡的发生机制及蛋白调节机制, 可以为相关疾病的治疗以及药物的开发提供新的思路。参考文献1牛素彦,李京云,杨