组织化学染色

特殊染色在临床病理学中的应用,染色的意义和目的,用染料对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于光镜观察和分析。病理染色属于生物性染色的范畴。,应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色剂，显示组织或细胞的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，称特殊染色（Special staining） 。,特殊染色（special staining）,染料和染色的原理,一、染料的特点：组织病理学染料是生物学染色剂对所染组织成分具有亲和力染色剂中同时具备发色团和助色团才具有染色功能发色团是使染料显色的化学团（色原），一种染料由一个或多个发色团，染料颜色取决于发色团多少和强弱。助色团指使色原产生电离成为盐类，对被染物产生亲和力的原子团,染料和染色的原理,二、染料的分类染料的来源分类：天然和合成染料化学反应分类：碱性染料、酸性染料、中性染料用途分类： 细胞核染料：苏木素，核固红，结晶紫等 细胞质染料：伊红，酸性复红，苦味酸等 脂肪染料：油红O，苏丹III，苏丹IV 纤维结缔组织染料：苦味酸，亮绿等,染料和染色的原理,三、染料的原理物理机制：毛细管渗透作用：染色剂沿组织间微孔渗透到组织中。吸收或溶解作用：组织吸收或溶解染料而着色，如脂肪染色吸附作用：染料的色素粒子浸润组织中，因分子引力，色素粒子被吸附而染色,例如脂肪染色: 苏丹类染色剂在脂质中的溶解度酒精中的溶解度 溶解于酒精的苏丹类染色剂与组织中的脂质接触时，染色剂就从溶液中“转移”到脂质中，从而使脂质着色。,染料和染色的原理,三、染料的原理化学机制： 组织和细胞中含有碱性和酸性物质，分别与染料中的阳离子和阴离子结合。 如HE染色：细胞核主要由核酸构成，与碱性染料-苏木素结合，而胞浆主要由碱性物质构成，与酸性染料-伊红结合。,普通染色：又称常规染色，即指HE染色（haematoxylin and eosin HE）特殊染色：除HE以外的所有染色，显示特定的组织结构和成分。单一染色：用一种染料进行的染色，如甲苯胺蓝染幽门螺杆菌多色染色：用两种以上染液染色的方法，如三色染色对比染色：又称复染或衬染，先将某一成分或结构染色后，再用另一种染料染其他成分，如苏木素衬染细胞核,染色的常用术语,进行性染色：渐进性染色，采用低浓度的染液，使组织成分着色自浅入深，直到达到合适强度，退行性染色：又称后退性染色，先使组织着色过度，再用某些溶液脱去多余染液，达到合适染色强度媒染剂：具有促进染色能力，对染料和组织都有亲和力并与染料和组织结合在一起的试剂。如硫酸铝钾等,染色的常用术语,促染剂：促使染料着色，增强染色能力，但本身不参与染色反应，如乙酸异染性染色：组织经过盐基性染料染色后，出现与染料不同的颜色分化：指用某种溶液选择性脱去过深的着色，并使不应着色的组织细胞成分脱色的过程，HE染色时的盐酸酒精分化蓝化作用（返蓝）：苏木素在酸性条件下呈红色，碱性条件下呈蓝色，HE染色时在酸分化后，再用碱性水使核变蓝，称蓝化,染色的常用术语,按照染色方法分类一般方法分类：常规染色，特殊染色等按主要组织和细胞成分分类：结缔组织染色，肌组织染色，神经组织染色按染色对象种类分类：切片染色法，组织块染色法，大体标本染色法,染色方法的分类,按发明者姓名命名：如Van. Gieson（VG）染色按所有染料分类：如苏丹IV染色，锇酸染色按所染组织分类：如网状纤维染色其他分类：,染色方法的命名,选择适当的组织处理方法：包括固定液和切片的选择，如脂肪和酶类染色需冰冻切片染色液的有效期和保存方式染色液的浓度和pH值染色时间的控制染色前切片的预处理：如脱甲醛色素，脱汞盐固定液的汞结晶等,染色中易出现的问题和对策,注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能达到目的，一般根据HE切片所见，选择适当的特染方法。必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。应做阳性切片作对照，保证染色结果的可靠性。染色所用的器皿都必须清洗。,染色中易出现的问题和对策,常用染色方法和应用,结缔组织由细胞和细胞间的骨架成分构成，分为无定形的间质（如硫酸盐和非硫酸盐黏多糖）和定形或纤维型间质（如胶原纤维，弹力纤维。网状纤维）。各种纤维成分的识别有助于病理学的诊断和鉴别诊断。,结缔组织染色,网状纤维的特性 网状纤维是构成组织的网状支架 广泛分布于实质器官内，其中最丰富的区域是肝脏、脾脏、淋巴结、骨髓、基膜、血管等形态学上为交织成网的纤细纤维化学成分为网状蛋白，一种特殊的胶原蛋白，抗酸病理状态下可转化为胶原纤维具有嗜银性，又称嗜银纤维HE染色着色淡，特殊染色可显示,结缔组织染色网状纤维染色,网状纤维染色的原理 网状纤维染色方法很多，但基本原理相同，即经过氧化剂的氧化使网状纤维对银离子具有选择性的亲和能力（嗜银性），并在媒染剂的作用下网状纤维吸附二氨合银离子，在经甲醛将其还原为黑色金属银而显示出网状纤维。,结缔组织染色网状纤维染色,常用网状纤维的染色方法 Gomori染色法 结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈黄色或黄褐色，细胞核呈灰黑色。 特点：此法简单可靠，染色时间短，常用于活检病理组织检查。,结缔组织染色网状纤维染色,网状纤维染色的应用肿瘤的诊断和鉴别诊断： 癌和肉瘤的鉴别：癌巢周围存在网状纤维；肉瘤中网状纤维围绕每个细胞 尤文氏瘤和淋巴瘤：尤文氏瘤无网状纤维，淋巴瘤内存在大量网状纤维 脑膜瘤和胶质瘤：脑膜瘤有网状纤维。胶质瘤少,结缔组织染色网状纤维染色,网状纤维染色的应用某些梭形细胞肿瘤的诊断：已被免疫组化取代，很少用 平滑肌瘤的瘤细胞间可见大量平行分布的网状纤维； 纤维肉瘤则见大量网状纤维密集包绕细胞； 滑膜肉瘤的梭形细胞产生网状纤维少。,结缔组织染色网状纤维染色,网状纤维染色的应用判断组织坏死的性质和预测坏死后的结局： 、凝固性坏死：用网染可以观察到早期凝固性坏死处网状纤维支架还保留的特点。 、肝炎的坏死范围和程度：如网状支架塌陷，则演变成肝硬化。,结缔组织染色网状纤维染色,网状纤维染色的应用骨髓网状纤维染色：,结缔组织染色网状纤维染色,580例骨髓病变网状纤维的染色结果,胶原纤维是结缔组织中含量最多的一种，皮肤，肌腱，硬膜等处丰富纤维母细胞合成，化学成分为胶原蛋白不溶于水，在酸性溶液中膨胀HE染色呈红色，易辨认出现质和量的改变时，与疾病状态有关,结缔组织染色胶原纤维染色,染色原理： 胶原纤维含碱性氨基酸，能够与酸性染料结合，酸性染料具有不同程度的扩散性，扩散性高的小分子容易进入结构致密的组织（肌纤维）间隙，扩散性低的大分子只可能进入结构疏松的组织（胶原纤维）间隙，从而产生不同的染色。,结缔组织染色胶原纤维染色,Van Gieson（V.G）染色：结果：胶原纤维鲜红色；肌纤维：黄色；细胞核：蓝黑色或灰色Masson三色染色：结果：胶原纤维绿色或蓝色；肌纤维：红色；细胞核：灰蓝色或灰黑色,结缔组织染色胶原纤维染色,应用：显示组织，器官损伤或炎症的修复与纤维化程度，如早期肝硬化显示与判断心肌坏死后被纤维组织取代的区域和病变的新旧程度：HE染色心肌与胶原呈红色，胶原染色则颜色不同；胶原染色新形成的胶原多呈细丝状，成熟后则粗大，不规则波浪状区别透明变性和淀粉样变性鉴别心肌纤维化和心内膜弹力纤维增生症肿瘤的鉴别诊断：纤维源性肿瘤的诊断,结缔组织染色胶原纤维染色,染色的方法和结果：Verhoeff铁苏木素染色结果：弹力纤维呈黑色，细胞核蓝色，胶原纤维呈红色,结缔组织染色弹力纤维染色,应用：（1）显示皮肤组织中弹刀纤维的变化：如硬皮病，皮肤松解症等（2）显示与判断心血管疾病： 鉴别心内膜弹力纤维症与心内膜心肌纤维化 动脉粥样硬化时粥样斑块低部弹力板的情况 高血压小动脉的改变 老年性动脉病变，动脉弹力板变性，增厚 （3）观察疾病时弹力板是否破坏,结缔组织染色弹力纤维染色,糖类物质除参与细胞代谢外，现已证实还参与多种细胞功能活动，包括蛋白折叠，细胞粘附，酶活动及免疫识别等，糖生物学已成为一门复杂的学科。 糖类可分为单糖，双糖，粘多糖，粘蛋白，粘脂等，病理学中最有意义的是糖原和黏多糖。 因糖原极不稳定，易自溶，因此做糖原分析的组织应在取材后立刻固定。糖原是水溶性的，建议最好使用酒精福尔马林。,糖类物质（碳水化合物）染色,染色原理： 过碘酸是一种氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1,2-乙二醇基使之变为二醛，醛与Schiff试剂结合形成亮红色的终产物-碱性品红。形成颜色的深浅取决于组织内反应的乙二醇浓度。结果： 糖原和其他PAS阳性物质呈红色，细胞核呈蓝色,糖类物质染色1、PAS染色（Periodic Acid Schiff PAS）,应用：肿瘤的诊断和鉴别诊断基底膜厚度的判断（肾病的诊断）基底膜的完整性病原菌感染的诊断,糖类物质染色1、PAS染色,糖类物质染色1、PAS染色,PAS反应阳性的物质,染色原理： 染色机制不清，可能是阿辛蓝中的异硫脲基通过静电与组织内的多聚阴离子相连。结果： 酸性粘蛋白（硫粘蛋白和唾液酸蛋白）： 蓝色 蛋白多糖和透明质酸： 蓝色 细胞核：红色,糖类物质染色2、AB染色,应用用于一般黏液性病变的观察。在肿瘤诊断与研究中： 用于肿瘤类型的鉴别，如黏液腺癌与未分化癌的鉴别，黏液表皮样癌与鳞癌的鉴别； 黏液染色还可以证明癌细胞是否浸润间质； 观察胃黏膜腺体的肠上皮化生等,糖类物质染色2、AB染色,组织中粘液物质的分类,糖类物质染色2、AB染色,中性黏多糖：主要存在于胃黏膜表面上皮、幽门腺、十二指肠腺等处；酸性黏多糖：其基质成分可分为硫酸性（HID染色呈棕黑色）和非硫酸性（AB染色呈蓝绿色）两种形式存在，主要分布于消化道、呼吸道及其他部位的黏液腺分泌物中；黏蛋白：是由糖和蛋白质结合而构成，故又称糖蛋白，见于各种组织上皮和腺体导管的分泌物中。,糖类物质染色,AB与PAS共同染色，亦称套染，对于显示和区别酸性黏液物质与中性黏液物质均有较好效果。结果： 酸性黏液物质呈蓝色，中性黏液物质呈红色，混合性黏液物质呈紫红色；细胞核呈浅蓝色。,糖类物质染色2、AB-PAS染色,脂类物质染色,染色方法和结果：苏丹染色法：脂肪染橙红色，细胞核淡蓝色（切片染色后不能长期保存)。Lillie油红O染色法：脂类物质呈鲜红色或橘红色，细胞核呈淡蓝色。以上两种染色的原理：是染料在脂质中的溶解度大于所用溶液的溶解度，染料被移入脂质中。均需要冰冻切片，甘油或甘油明胶封固。锇酸染色：锇酸与脂肪形成不溶于有机质的氢氧化锇；黑色脂肪呈黑色，类脂质颗粒呈褐色。应用组织块浸染。,脂类物质染色,应用：证实和区别脂肪变性。显示病变的脂质沉着，如动脉粥样硬化斑块内胆固醇沉积；显示脂肪栓塞；显示先天性类脂质沉积病，如戈谢病（Gaucher disease），尼曼皮克病（Niemann-Pick disease ）等。脂肪源性肿瘤的诊断和鉴别,淀粉样物染色,淀粉样物质（Amyloid）是一种细胞外无定形，嗜酸性物质，刚果红染色后在偏正光镜下呈“苹果绿”的双折射，具有独特的原纤维超微结构，大多数由B-折叠层构象的蛋白质构成。 淀粉样物的沉积与很多疾病有关，不同疾病所构成的淀粉样物的蛋白质不同。如骨髓瘤相关淀粉样变为免疫球蛋白轻链；Alzheimer病为淀粉样蛋白B前体。,染色方法和结果：刚果红染色：淀粉样物，弹力纤维呈红色，核呈蓝色甲基紫染色：淀粉样物呈紫红色，细胞核和基质呈蓝色染色的原理： 机制不清楚,淀粉样物染色,应用：肿瘤的诊断与鉴别：如甲状腺髓样癌、胰岛细胞瘤、肺小细胞癌可 出现淀粉样物质，染色阳性对诊断提供可靠依据。识别器官的淀粉样变性：如舌、喉、肝脾、肠道及皮肤等,淀粉样物染色,微生物的染色,微生物主要包括：病毒细菌真菌原虫寄生虫,微生物的染色细菌染色,Gram碱性复红结晶紫染色：应用：识别Gram菌的感染结果：Gram阳性菌呈蓝色，阴性菌和细胞核呈红色原理：Gram阳性菌含核糖核酸镁盐-蛋白质复合物多，摄取结晶紫多且较牢固，呈蓝色或紫色，而Gram阴性菌则较少，易与碱性复红结合呈红色,微生物的染色细菌染色,抗酸染色（Ziehl-Neelsen染色）：应用：识别分枝杆菌，如结核杆菌和其他分枝杆菌结果：分枝杆菌呈红色，背景淡蓝色原理：分枝杆菌细胞壁含大量脂质，主要成分是分枝菌酸，它具有抗酸性，可与染料中石碳酸复红结合，抵抗盐酸乙醇的脱色。,微生物的染色细菌染色,其他细菌的染色Wathin-Starry染色显示螺旋体，菌体呈黑色，背景呈金黄色改良Steiner染色：螺旋体，猫爪病病原体，非放线菌呈深棕黑色，背景呈亮黄色至金黄色,微生物的染色真菌染色,真菌（fungus）种类较多，常见的致病菌如毛霉菌、曲菌、隐球菌、放线菌和白色念珠菌等。真菌的基本结构成分是含较多的黏多糖和蛋白质。常形成肉芽肿和坏死培养是最好的方法,微生物的染色真菌染色,Grocott六胺银染色法 结果：真菌孢子和菌丝呈黑褐色，细胞核呈红色，背景呈淡绿色。 原理：铬酸氧化真菌内的多糖化合物，醛基暴露，醛基将六胺银中的银还有呈黑色的金属银过碘酸-Schiff （PAS）反应法： 结果：真菌呈紫红色，红细胞呈淡黄色。 原理：,色素和矿物质,生物体内的色素可分为：1）内源性色素： 血源性色素：含铁血黄素，血红素，卟啉等 非血源性色素 内源性矿物质2）人工色素：组织成分和一些化学物质之间相互作用后产生的物质沉积，如福尔马林色素3）外源性色素和矿物质：外源性物质进入人体,色素和矿物质染色,铁染色： 组织内沉积的铁质主要以含铁血黄素的方式存在，HE染色下呈黄色至褐色颗粒，以氢氧化铁形式存在于蛋白质结构中，含铁血黄素中的铁可分为三价和二价铁，可用不同方式显示。,色素和矿物质染色,Perls blue（普鲁士蓝）染色： Perls blue（普鲁士蓝）反应显示三价铁 原理：盐酸与含铁血黄素中的三价铁反应形成三氯化铁，三氯化铁与亚铁氰化钾反应生成一种稳定的化合物蓝色的亚铁氰化铁（普鲁士蓝）。 结果：含铁血黄素呈蓝色，其他组织浅红色。,色素和矿物质染色,Turnbull-Sehmaltzer铁染色：显示二价铁和三价铁 原理：组织中同时含有二价和三价铁，经硫化氨处理后三价铁转变为二价铁，原来存在的二价铁不变，与Turnbull反应呈蓝色，若不经硫化氨处理，直接与turnbull反应，则只显示二价铁结果：含铁血黄素呈蓝色，其他组织浅红色。,色素和矿物质染色,黑色素（Melanin）在黑色素母细胞内合成，黑色素母细胞起源干神经脊，在胚胎发育过程中，由神经脊移行到皮肤、眼和中枢神经系统。 皮肤的表皮、毛囊、眼的虹膜、睫状体、脉络膜，脑的软脑膜、黑质、蓝斑、迷走背核，以及交感神经节和脊神经节的节细胞内均可有黑色素沉着。,Masson-Fontana银染色法原理：黑色素具有还原性，嗜银，将染液中银还原后使黑色素着色 结果：黑色素及嗜银细胞颗粒呈黑色。