【硕士论文】腐烂病菌自苹果枝条剪锯口侵染条件、扩展动态与防治药剂研究

腐烂病菌自苹果枝条剪锯口侵染条件、扩展动态与防治药剂研究,研究生：陈冲导 师：李保华 教授,目录,1,3,4,5,研究背景田间剪锯口的系统接种 温度、湿度对分生孢子自剪锯口侵染和 扩展的影响伤口龄期对病菌侵染与发病的影响冻害、干旱等对潜伏病菌扩展致病的影响不同杀菌剂的防治效果小结与讨论,Text,Text,Text,Text,研究背景,2015届硕士论文答辩,研究背景,一、苹果树腐烂病的发生与危害 苹果树腐烂病(Valsa mali)是世界苹果产区危害最为严重的枝干病害，侵染主枝、主干，破坏枝干皮层，轻者造成枝干枯死、残缺，重者整株枯死，甚至毁园，严重制约着苹果产业的发展。 1903年首次在日本发现苹果腐烂病，并于1916年在我国辽宁省熊岳城被报道。自解放初期，我国腐烂病曾有四次大规模流行，几乎毁灭了建国后发展起来的所有苹果园。全国苹果产业体系调查结果显示，我国各苹果产区的苹果树腐烂病的总体发病率达52.7%，2011年，烟台苹果产区腐烂病再次猖獗发生，结果园内新发病疤的病株率达68.20%，平均受害枝量为23.98%，死枝量10.74%，有关专家认为,我国的苹果产区正面临着新一轮腐烂病的流行。,腐烂病主要造成死枝、死树和毁园,研究背景,二、苹果树腐烂病的侵染 苹果树腐烂病菌是一种弱寄生菌，具有潜伏侵染的特点，主要从剪锯口、冻伤、日灼伤等伤口侵染，其中剪锯口是腐烂病菌最易侵染的部位。苹果枝条修剪后，自剪锯口渗出的伤流液中含有大量的养份为腐烂病菌孢子的萌发和侵染提供了有利条件。从剪锯口侵染的腐烂病菌，并不能立即致病，而是潜伏在木质部的导管内和附着于伤口表面，其中木质部导管内的病菌是导致剪锯口发病、旧病斑复发的主要菌源。2011年烟台苹果产区所检查的967块病斑中，源自剪锯口的病斑占80.04%。潜伏于寄主木质部内的腐烂病菌大多从剪锯口侵染。,在剪锯口上，腐烂病菌主要从木质部侵染,当年的剪口很少发病，病斑多出现在2-3年的剪锯口上,木质部内病菌扩展导致病斑复发，病斑复发率超过60%,研究背景,三、苹果树腐烂病的防治农业防治：以加强果园栽培管理和增强树势为重点，提高寄 主的抗性，主要从果园管理、树体修剪、清除菌源等方面全面保护树体。生物防治：主要筛选具有拮抗性的内生放线菌、真菌、细菌防治腐烂病。化学防治：筛选出了石硫合剂、福美胂等一些防效较好的药剂，但在实际应用中未能很好的防治腐烂病的发生。在实际生产中还没有发现具有高渗透性的化学药剂能够渗透寄主木质部杀死腐烂病菌从而达到治愈腐烂病的目的。,研究的目的和意义,剪锯口是腐烂病菌重要的侵染孔口，木质部导管内的腐烂病菌是导致剪锯口发病和旧病斑复发的主要菌源。因此研究腐烂病菌自苹果枝条伤口侵染条件、扩展动态为腐烂病害的深入研究提供理论基础。由于目前实际的生产中还没有发现能够完全防治腐烂病发生和流行的化学药剂。因此对腐烂病菌自苹果枝条伤口侵染的防治药剂进行研究，为生产上保护剪锯口提供指导性建议，以期为苹果树腐烂病的防控提供依据和参考。,Text,Text,Text,Text,田间剪锯口的系统接种,2015届硕士论文答辩,方法：,供试菌株：腐烂病菌转化菌株(ATMT,gfp),分生孢子(大麦粒培养基)接种方法： 3月24日，3年生富士苹果的12年生枝条，直径1cm，距基部20cm处形成剪口。7d后，分生孢子直接涂抹木质部，湿棉球包裹，塑料膜包扎，保湿48h，每隔一个月左右接种一次，20个/次。3月31日形成剪口，当天接种，60个枝条。检查方法：定期调查 (剪口下方长径超过1cm典型腐烂病斑)。剪取6个/月，去皮层，自接种端以0.5cm为单位，以髓部为中心按十字交叉法平分成4块，转移至PDA培养基(50g/mL潮霉素)中，25培养，以此推断腐烂病菌在苹果枝条木质部内的扩展速度。,不同时期剪口接种腐烂病菌后的发病率,在3、4和5月份接种枝段发病数分别为8、9和9，发病率为40%、45%和45%；其次是8和9月份，发病数为6和5个，发病率为30%和25%； 在7月份发病剪口数为3个，发病率为10%；在11月份发病数最少仅1个，发病率最低为5%。,不同时期剪口接种腐烂病菌的发病动态,次年3月份开始发病，其中3、4和8月发病数量最多，为16、13和10个，发病剪锯口分别占总接种剪锯口的10%、8.13%和6.25%，其他时期发病的剪锯口占2.51%。,不同时期剪口接种腐烂病菌的发病动态,6月份，腐烂病菌在木质部内的生长扩展速度最快，月平均扩展距离1.46cm， 4、5和7月份次之，月平均扩展距离为0.5cm、0.67cm和1.1cm；7月份之后菌丝的扩展明显变慢，月平均扩展距离不超过0.3cm。次年6月份，在木质部内的扩展距离长达21cm。,Text,Text,Text,Text,Text,温度、湿度对分生孢子自剪锯口侵染和扩展的影响,2015届硕士论文答辩,分生孢子自木质部侵染的过程,B3,温度、湿度对分生孢子自剪锯口侵染和扩展的影响,试验设置：7个露温7个露时=49个处理组合 (5C、10C、15C、20C、25C、30C、35C) (保湿0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h)每个处理3个枝条。不同时间重复3次接种方法:3月份，5年生富士苹果树一年生枝条，截成20cm枝段，保持剪口整齐，枝条水培, 相应温度预处理12h。转化菌株分生孢子悬浮液(106个/ml)均匀喷撒剪口上，套袋保湿48h。72h后，接种端浸入75% 的酒精10s，转入25、相对湿度75%恒温箱培养7d。病菌分离方法：去皮层,自接种端以1cm为单位，依次截取5个枝段，以髓部为中心按十字交叉法平分成4块，用75%的酒精浸泡2min，PDA培养基(50g/mL潮霉素)中，4块/皿， 25培养。自第2d开始，每天检查直到第10d结束。调查记录方法：统计每个处理同一深度12个枝段中带菌组织的块数和计算带菌百分率,接种枝条在25下培养7d后距接种点3cm处病菌的分离率,在距接种点3cm处的枝段上，除35，其他6个温度下接种的枝段上都能分离出腐烂病菌。20下病菌的分离率最高，为29.4%，35下接种枝条上，1cm处能分离到接种病菌。露时对腐烂病菌分生孢子从苹果枝条剪口侵染没有显著影响。接保湿24h的分离率最高，为17.86%。,根据该模型，苹果树腐烂病菌分生孢子从剪锯口侵染木质部的最适温度为19.69。,不同露温和露时组合下距接种点不同距离处病菌的分百分率,15-30在距接种点5cm处能分离到接种病菌，分离率分别为9.92%、25.40%、9.52%和5.16%。35下1cm处能分离到接种病菌，这表明35下腐烂病菌的分生孢子也能从剪锯口侵入，但病菌的侵染率低或侵入后生长缓慢。,温度对分生孢子自剪锯口侵染和扩展的影响,试验设置：7个温度处理 (5C、10C、15C、20C、25C、30C、35C) 每个处理6个枝条。不同时间重复3次。接种方法: 3月份，5年生富士苹果树一年生枝条，截成20cm枝段，25水培, 预处理12h。分生孢子悬浮液喷雾接种，套袋保湿，48h后，取出接种枝条，6个/组，转入7个不同温度培养7d。病菌分离方法：去皮层,自接种端以1cm为单位，依次截取2个枝段，以髓部为中心按十字交叉法平分成4块，用75%的酒精浸泡2min，PDA培养基(50g/mL潮霉素)中，4块/皿， 25培养。自第2d开始，每天检查直到第10d结束。调查记录方法：统计每个处理同一深度24个枝段中带菌组织的块数和计算带菌百分率。,温度对侵染、扩展的影响,除35，在25下培养7天后，距接种点5cm处枝段上都能分离到接种病菌，25分离率最高，为57.87%；35下培养的枝条上，在3.5cm处能分离到病菌；其他温度下培养的枝条上，在4.5cm处都能分离到接种病菌。,Text,Text,Text,Text,Text,Text,2015届硕士论文答辩,伤口龄期对病菌侵染与发病的影响,方法：,试验设置：7个时间处理(1d、3d、7d、15d、30d、45d、60d)每个时间处理30个伤口。在生长季节以同样方法重复一次。伤口处理：2014年4月选取5年生富士苹果树的一年生枝条，自基部10cm处向上，用灭菌打孔器以10cm为间隔打孔，伤口方向随机，去除树皮表层不伤及木质部,共形成伤口210个。接种方法：将新鲜腐烂病菌菌饼带有菌丝的一侧贴向枝条的伤口处，保鲜膜包扎固定，保湿48h。测量方法：接种后每隔7d测量一次病斑大小(长、宽)计算方法：病斑面积= 长宽；发病率,春季伤口龄期对腐烂病病斑扩展的影响,春季形成的伤口感病期较长。接种7d后，龄期为1d、3d和7d的伤口对接种菌饼后发病率为100%；15d、30d和45d的伤口接种后发病率依次降低，分别为57%、17%和3%；龄期60d的伤口再接种后不再发病。龄期1d的伤口病斑扩展面积最大，为10.33cm2；随伤口龄期的增加，病斑的面积逐渐减小。,夏季伤口龄期对腐烂病病斑扩展的影响,夏季形成的伤口感病期较短。接种7d后，龄期为1d和3d的伤口接种腐烂病菌后的发病率为100%，15d后的伤口接种菌饼后不再发病。龄期为1d的病斑最大面积，为5.62cm2。,春季伤口发病率和病斑扩展速度明显高于夏季，发病伤口的龄期也相对较长。7d时，病斑面积相差最大6.24cm2,春夏季、枝条伤口龄期对腐烂病病斑扩展的影响,病斑的扩展面积随着枝条龄期的增长而降低。接种7d后一年生伤口病斑的平均扩展面积为3.12cm2，显著大于主干，但两年生和多年生病斑的扩展面积差异不显著。,Text,Text,Text,Text,Text,Text,2015届硕士论文答辩,冻害、干旱等对潜伏病菌扩展致病的影响,方法：,接种方法：2014年9月底，3年生富士一年生枝条，75%酒精表面消毒，无菌锯条随机造成伤口。分生孢子悬浮液(106个/ml)喷雾接种。保湿48h,伤口处理：浅层伤口：仅破坏树皮表皮层不伤及木质部；深层伤口：伤口深达木质部。冻害处理：低温冰冻处理6h、24h、12h冰冻和25C水培12h交替处理1周； 25水培为对照。共8个组合，6个枝条/组合。干旱失水：分为三个水平：叶片开始萎蔫后再浇水；叶片全部萎蔫后再浇水；萎蔫直到树体死亡。正常浇水为对照。共8个组合，6个枝条/组合。调查记录方法：记录枝条、芽眼、伤口的发病数量 发病率(%)=(发病个数/全部调查总个数)100%,低温冻害潜伏病菌扩展致病的影响,浅层伤口对照组芽眼发病率最高，为6.29%，伤口发病率仅为0.56% ；冰冻12h/12h的芽眼发病率最低，为2.88%；冰冻6h和12h/12h伤口发病率最高，为1.11%；,深层伤口冰冻6h的芽眼发病率最高，为7.15%，伤口发病率仅为1.67% 冰冻12h/12h的芽眼发病率最低为3.80%；冰冻24h的伤口发病率最高，为2.78%,干旱失水对潜伏病菌扩展致病的影响,干旱失水对潜伏病菌扩展致病的影响不是很明显。2014年9月下旬，三种干旱条件处理下的盆栽苹果树接种枝条，至次年4月在所有接种枝条的伤口处理中仅有4个伤口处出现腐烂病斑，均出现在处理枝条顶端伤口处，处理枝条浅层伤口出现1个腐烂病斑，深层伤口处出现3个。,Text,Text,Text,Text,Text,Text,2015届硕士论文答辩,不同杀菌剂的防治效果,杀菌剂对潜伏病菌的铲除效果,方法:采用先接种后施药，施药后诱导发病的方法接种方法：2014年10月下旬，3年生盆栽富士苹果树的一年生枝条，枝条长约60cm。采用分生孢子喷雾接种法，保湿48h。施药方法：接种两周后施药，建议浓度，除波尔多液外，喷雾施药。每种药剂处理6个接种枝条，以清水为对照，共处理36个枝条。诱导发病：施药2周后，自枝条基部剪下，条剪成20cm长的枝段，用小锤轻敲枝段(只破坏皮层)，石蜡密封上端，25水培，观察枝条的发病情况。统计方法：药剂防效(%) =（对照20个组织块中平均受侵染的块数-处理20个组织块中平均受侵染的块数）100%对照20个组织块中平均受侵染的块数,所需药剂,杀菌剂对潜伏病菌的铲除效果,腐烂病菌接种2周后，喷施吡唑醚菌酯和波尔多液对潜伏病菌的铲除效果较好，分别达94.4%和88.9%；代森锰锌、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑3种效果稍差，分别为44.4%、44.4%、16.7%。,杀菌剂对剪锯口的保护效果,方法：采用先施药后接种的方法试验设置：4个时间处理(2d、5d、10d和20d) , 8个药剂处理，以清水为对照，共36个组合。不同时间重复3次。施药方法：5年生富士苹果树一年生健康枝条，截成20cm枝段，药液均匀的喷洒在枝条剪口，5个/组，25水培。接种方法：施药后第2d、5d、10d和20d，接种。将腐烂病菌转化菌株分生孢子悬浮液喷雾接种，25,保湿48h，拆袋后25培养10d。统计方法：药剂防效(%) =（对照20个组织块中平均受侵染的块数处理20个组织块中平均受侵染的块数）100%对照20个组织块中平均受侵染的块数,杀菌剂对剪锯口的保护效果,施药后第2d，8种测试药剂的保护效果稍差，从剪口接种侵染的病菌量较大；从施药后第5d开始，其中7种药剂的保护效果明显提高，病菌的的侵染量明显减少；施药20d后，甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯、波尔多液、戊唑醇的保护效果仍在90%以上。,杀菌剂对已侵染病菌的抑制效果,方法：采用先接种后施药的方法试验设置：4个时间处理(2d、5d、10d和20d) , 3个药剂处理，以清水为对照，共16个组合。不同时间重复3次。接种方法：2014年10月下旬，3年生盆栽富士苹果树一年生枝条，枝条长约60cm。采用分生孢子喷雾接种法，保湿48h。施药方法：接种两周后施药，建议浓度，除