荧光偏振分析方法

第6章荧光偏振分析方法 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 光的偏振性 非偏振光原理图 偏振光原理图 自然光在各个方向振动是均匀分布的 一束光线都在同一方向上振动 荧光偏振 FluorescencePolarization FP Polarizedexcitation 1926年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象 如果被激发的荧光物质处于静止状态 该物质仍将保持原有激发光的偏振性 如果被激发的荧光物质处于运动状态 该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性 也就是所谓的荧光去偏振现象 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 如何衡量 偏振值的定义 偏振值一般以mP 毫偏 来表示 对于完全偏振发射 P r 1 对于自然光 P r 0 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 偏振值的影响参数 偏振值衡量荧光分子的运动性 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 分子的偏振性与分子旋转弛豫时间成比例 分子旋转弛豫时间是分子转过68 5度角时所用的时间 分子旋转弛豫时间与介质黏度 绝对温度 分子体积和分子重量和气体常数有关 20世纪50年代Weber进一步拓展了荧光偏振理论并首次将荧光偏振用于生化分析领域 20世纪80年代 随着荧光探针和荧光偏振分析仪器商业化 荧光偏振技术在生命科学等各个领域扮演越来越重要的角色 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 荧光偏振分析的一般步骤 利用荧光偏振的原理 通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前后分子量的变化 计算水平方向及垂直方向的荧光值作相关分析 如果被检测分子大 激发时运动慢 测得的荧光偏振光值高 如果分子小 分子旋转或翻转速度快 发射光相对于激发光平面将去偏振化 测得的偏振光值低 从而计算出样品的偏振值 偏振值单位mP 通过专用分析软件 可对检测结果进行分析 判别等工作 荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势 特别是不生成有害的放射性废物 并且检测限更低 可达亚纳摩尔级范围 此外荧光偏振是真正均相的 允许实时检测 动力学检测 对于浓度变化不敏感 是均相检测形式 中间不含洗涤步骤 的最佳解决方案 荧光偏振技术的优势 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 常用的测试仪器及配件 国内外研究现状及发展动态分析 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 1 荧光偏振免疫分析 荧光偏振免疫分析法 fluorescencepolarizationimmunoassay FPIA 是一种定量免疫分析技术 荧光偏振免疫分析原理 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 1 荧光偏振免疫分析 近年来 FPIA备受生物 化学 医学专家们的亲睐 有关FPIA在临床化学 农药残留分析 食品安全 环境监测中应用的报道逐年增加 成为生化分析和环境监测中强有力的工具 优点 均相分析无需分离 迅速 灵敏 无放射性污染 重现性高 缺点 FPIA不如酶联免疫吸附测定 ELISA 灵敏 且荧光标记物可能会与样本中的基质特异性结合 使荧光偏振值增加 产生一定干扰 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 蛋白质与核酸的相互作用是许多生命活动的重要部分 因此成为分子生物学研究的一个热点 荧光偏振技术为研究蛋白质 核酸相互作用提供了一个免分离 免放射性的途径 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 2 蛋白质 核酸相互作用 2 蛋白质 核酸相互作用 核酸适配体 aptamer 是通过SELEX技术筛选得到的能与蛋白质 小分子 金属离子等靶标结合的寡核苷酸序列 由于其易合成和修饰 稳定性好 成本低 已广泛应用于分析应用领域 传统分子量依赖性FA用于研究蛋白质 核酸相互作用的原理 Biosens Bioelectron 2012 32 148 154 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 3 核酸分析 Chem Commun 2011 47 3478 3480 改进传统的荧光偏振检测方法 通过引入酶促反应扩增检测信号应用于超灵敏检测特异性DNA的检测 超灵敏检测DNA 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 3 核酸分析 NucleicAcidsRes 2003 31 e70 实时监测DNA双链的形成和解链过程 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 4 水解酶催化反应 Chem Rev 2010 110 2685 2708 实时监测蛋白酶催化过程 蛋白酶对机体的新陈代谢和生物调控起到非常重要的作用 蛋白酶酶活的评估有助于理解特定的生化途径 开发治疗药物 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 Anal Chem 2009 81 7468 7473 非竞争法检测小分子化合物 5 小分子分析 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 空间构象变化 Anal Bioanal Chem 2011 401 3229 3234 磷酸二酯酶I介导的荧光偏振传感平台 5 小分子分析 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 Chem Commun 2012 48 10004 10006 多元检测方法 5 小分子分析 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 传统荧光偏振分析技术面临的挑战 荧光偏振变化量较小 灵敏度较低 解决的方案 MAP探针 MassAmplifyingProbe 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 Anal Chem 1995 67 3945 3951 核酸检测 蛋白质增强荧光偏振 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 Anal Chem 2012 84 5535 5541 小分子检测 蛋白质增强荧光偏振 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 凝血酶 thrombin 小分子检测 Anal Chem 2012 84 7203 7211 蛋白质增强荧光偏振 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 单链结合蛋白SSBP Single strandbindingproteins 离子检测 Analyst 2012 137 2770 2773 特殊结构核酸增强荧光偏振 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 一 调节机体和细胞的渗透压二 调节体液的酸碱平衡三 参与体内蛋白质和糖类的代谢四 维持正常的神经兴奋性和心肌运动 K 的作用 离子和小分子检测 Chem Commun 2014 50 2049 2051 特殊结构核酸增强荧光偏振 6 1传统荧光偏振技术及发展情况概述 与蛋白质和核酸相比 纳米材料具有良好的热稳定性 更大的质量和体积且易于合成和进行表面修饰 因此用纳米材料增强荧光偏振具有潜在的应用价值 纳米材料 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 纳米粒子显著增大了分子相互作用的荧光偏振值变化 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 Angew Chem Int Ed 2008 47 8386 8389 汞离子检测荧光偏振探针检测限达到0 2ppb 比传统荧光偏振方法提高3个数量级 检测时间只需20分钟 具有良好的特异性 MAP探针 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 AuNP DNASystem DNA DNASystem AuNPEnhancement 0 2ppb QuantitativeAnalysis Anal Biochem 2010 401 47 52 DNAzyme自组装荧光偏振探针 MAP探针 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 Chem Commun 2012 48 7480 7482 纳米二氧化硅颗粒增强荧光偏振探针 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 Chem Commun 2011 47 4763 4765 核酸酶检测及药物筛选 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 BiosensorsandBioelectronics 2013 41 569 575 基于链置换反应开发的纳米金颗粒增强荧光偏振探针 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 J Mater Chem B 2013 1 2018 2021 T4polynucleotidekinaseactivityandinhibition 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 Chem AsianJ 2014 9 2755 2760 聚乙烯纳米颗粒增强荧光偏振信号放大分析方法 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 金纳米颗粒 硅纳米颗粒等虽然能有效增强荧光偏振值 但是探针与纳米颗粒需要复杂的共价连接 开发一种普适 简单的荧光偏振增强剂仍然是一个重要的任务 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 纳米材料的生物功能化方法 非共价功能化途径 静电相互作用 堆积作用 范德华力 碳基纳米材料 石墨烯 碳纳米管 碳纳米颗粒等 ssDNA dsDNA与碳基纳米材料之间的相互作用差别悬殊 与DNA发生 堆积作用 与多肽发生 静电作用等 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 Chem Commun 2013 49 1942 1944 氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 signal off signal on Anal Chem 2013 85 1424 1430 氧化石墨烯增强荧光偏振信号分析方法 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 MaterialsScienceandEngineeringC2014 38 206 211 碳纳米颗粒增强荧光偏振信号分析方法 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 BiosensorsandBioelectronics 2014 54 285 291 碳纳米管增强荧光偏振信号分析方法 6 2纳米增强荧光偏振一般策略及应用 Chem AsianJ